HBV對補體殺傷作用的影響及LPS對胞內(nèi)DNA免疫的作用研究.pdf

1、第一部分:HBV及其片段HBc、HBx對補體介導的肝細胞殺傷作用的影響研究
　　 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)在感染肝細胞中極易發(fā)生基因片段的整合從而導致病毒在機體內(nèi)長期存在不易被清除,如今已經(jīng)成為世界性難題。目前關于乙肝及其所致肝癌的發(fā)病機制還不是很明確。本課題組前期實驗表明,HBV全基因,HBx,PreS2均可提高肝細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性。另已有研究證實,補體系統(tǒng)在保護機體抵抗病毒感染

2、中發(fā)揮重要作用,急性期補體成分C3、C4的胞漿水平與患者疾病的轉(zhuǎn)歸有著密切的聯(lián)系。
　　 補體系統(tǒng)由約30種可溶性及膜結(jié)合型蛋白組成,其中近90％的胞漿補體成分及可溶性的補體調(diào)節(jié)蛋白都是在肝臟(主要是肝細胞)中合成的。生理條件下,所有的補體成分處于自發(fā)地低水平活化狀態(tài),體內(nèi)的這種活化對機體細胞形成潛在的威脅。然而,機體細胞可表達數(shù)種能夠抑制自身補體活化從而保護自身的胞漿和膜蛋白,目前已知至少有10種可溶性和膜結(jié)合型蛋白。人類肝細

3、胞表達CD59,CD55,CD46和CFH,其中CD55,CD46和CFH都通過限制C3活化發(fā)揮作用,而CD59則通過抑制MAC形成起作用；阻斷CD59可顯著提高補體對肝細胞的殺傷率,而阻斷CD55,CD46,CFH作用不明顯。因此CD59被認為是肝細胞中最重要的補體調(diào)節(jié)蛋白。于是我們提出一個問題:HBV對補體殺傷感染肝細胞的活性有何影響?其作用機制是什么?HBV片段HBc、HBx是否參與補體殺傷作用的調(diào)節(jié)?
　　 目的:

4、>　　 1.探討HBV感染對補體介導的細胞殺傷作用的影響及其機制。
　　 2.探討HBV片段HBc、HBx誘導對補體殺傷的影響。
　　 方法:
　　 1.高通量分析HBV感染對肝細胞基因表達譜的影響
　　 1.1 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠基因芯片分析
　　 1.2 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠蛋白質(zhì)組學分析
　　 2.HBV表達對補體介導的肝細胞殺傷的影響
　　 2.1表達HBV的肝癌細胞模型的建立

5、
　　 2.2HBV表達對補體介導的肝細胞殺傷的影響
　　 2.3 HBV感染對補體調(diào)節(jié)蛋白CD59表達的影響
　　 2.4 CD59在補體殺傷HBV感染細胞中的作用
　　 3.HBV片段HBc、HBx表達對補體殺傷的影響
　　 3.1表達HBc、HBx的肝癌細胞模型的建立
　　 3.2 HBc、HBx表達對補體調(diào)節(jié)蛋白CD59表達的影響
　　 3.3 HBc、HBx表達對補體介導

6、的肝細胞殺傷的影響及機制
　　 3.3 CD59蛋白水平表達的調(diào)控機制
　　 結(jié)果:
　　 1.HBV表達明顯改變補體成分的表達
　　 2.HBV表達對補體介導的肝細胞殺傷的影響
　　 3.HBV片段HBc和HBx對補體介導的肝細胞殺傷作用的影響
　　 結(jié)論:
　　 1.HBV表達可明顯改變補體系統(tǒng)的表達譜,對補體系統(tǒng)的調(diào)控可能是HBV致病的機制之一。
　　 2.HBV表達

7、可提高肝細胞對補體殺傷的敏感性,證實HBV具有促進補體殺傷的生物學活性。
　　 3.HBV感染可在RNA和蛋白水平抑制肝細胞內(nèi)CD59的表達。
　　 4.HBV表達提高肝細胞殺傷敏感性這一作用主要是通過下調(diào)CD59而發(fā)揮的。
　　 5.HBV片段HBc可在蛋白水平抑制肝細胞內(nèi)CD59表達并進而提高細胞對補體殺傷的敏感性,可能是HBV發(fā)揮作用的一個關鍵片段。
　　 6.HBx對CD59和補體殺傷活性均無顯著

8、影響。
　　 創(chuàng)新點及意義:
　　 1.本研究首次結(jié)合高通量分析的方法對HBV影響的基因表達譜尤其是補體基因表達譜進行了分析,有利于從總體上理解HBV的作用。
　　 2.本研究通過HBV表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同肝細胞系,首次發(fā)現(xiàn)HBV表達可提高肝細胞對補體殺傷的敏感性,為進一步闡明HBV感染相關疾病的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。
　　 3.本研究分別利用HBV感染的細胞模型、動物模型和臨床標本檢測了CD59的表達水平,

9、首次發(fā)現(xiàn)HBV感染可下調(diào)CD59表達,為研究補體調(diào)節(jié)蛋白在HBV感染中的作用奠定了基礎。
　　 4.應用抗體阻斷CD59作用的方法,首次證實HBV提高補體殺傷敏感性的作用是通過下調(diào)CD59表達發(fā)揮的。闡明了HBV影響補體作用的機制,為臨床治療提供新的靶點。
　　 5.在研究HBV全基因?qū)ρa體殺傷功能影響的基礎上,本研究又深入探討了HBV片段HBc和HBx對補體功能的作用,初步篩選了HBV影響補體殺傷的關鍵片段。
　

10、　 第二部分:LPS預處理對胞內(nèi)DNA免疫的影響
　　 固有免疫系統(tǒng)通過模式識別受體來識別病原體感染,從而啟動免疫應答。病原體刺激主要分為兩類:一類是病原體特異性產(chǎn)物,如LPS,LTA等；第二類包括病原體核酸。已知部分TLRs可以識別核酸,如TLR3識別單鏈RNA,TLR9識別CpC。最近研究發(fā)現(xiàn)胞漿雙鏈DNA可以不依賴于TLR而引起機體的免疫應答,其受體尚不明確(可能為DAI或其他分子),進入細胞后可以激活TANK結(jié)合激酶(

11、TBK1),進而活化IRF3,促進Ⅰ型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生并分泌大量干擾素。
　　 LPS是革蘭氏陰性菌表面的一種脂多糖,能被固有免疫細胞表面的TLR4識別,分別經(jīng)MyD88依賴途徑活化NF-κB,經(jīng)MyD88非依賴途徑即TRIF途徑活化IRF3和NF-κB,從而產(chǎn)生大量細胞因子和Ⅰ型干擾素。當給予細胞兩次LPS后,其分泌的細胞因子和干擾素顯著降低,稱為LPS耐受。在LPS耐受時,并非所有基因均被抑制,部分基因甚至表達更強。應

12、答受抑制的現(xiàn)象也出現(xiàn)在當LPS與其他TLR的刺激物先后作用時,稱為交叉耐受。那么LPS對DNA免疫的影響又是如何呢??作用機制又是什么?其作用是否與LPS耐受一致從這幾個問題出發(fā),我們研究了LPS對DNA免疫的影響,并取得了一定的研究成果。
　　 目的:
　　 探討LPS預處理對細胞內(nèi)DNA免疫的影響及其機制。
　　 方法:
　　 1.LPS預處理對胞內(nèi)B-DNA免疫產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素的影響
　　

13、1.1 LPS預處理對化學合成DNA轉(zhuǎn)染誘導的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的影響LPS預處理對DNA轉(zhuǎn)染效率的影響
　　 1.2 LPS預處理對細菌DNA感染誘導的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的影響
　　 1)LPS預處理對細菌轉(zhuǎn)染效率的影響
　　 實時定量PCR:LPS預處理RAW264.7后24h后,按照MOI為6:1加入LM,4h后提取基因組DNA,實時定量PCR檢測細菌基因組與細胞基因組的相對量。
　　 流式細胞術:LPS預

14、處理RAW264.7后24h后,按照MOI為6:1加入GFP-LM,4h后充分洗滌細胞,流式細胞儀檢測GFP陽性細胞比例。
　　 2)LM感染RAW264.7
　　 按照MOI為6:1感染經(jīng)或不經(jīng)LPS預處理的RAW264.7細胞4h后,提取RNA,實時定量PCR檢測Ifnb1的表達。
　　 2.LPS預處理影響B(tài)-DNA免疫的機制
　　 2.1基因轉(zhuǎn)錄水平
　　 建立熒光報告系統(tǒng),將含有Ifnb

15、1啟動子的熒光報告載體轉(zhuǎn)染HEK293-TLR4細胞,24h后,以LPS刺激該細胞,再24h后,轉(zhuǎn)染10μg/ml DNA,20h后雙熒光報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。
　　 2.2細胞通路水平
　　 以LPS刺激RAW264.7細胞24h后,再轉(zhuǎn)染DNA,于不同時間點分別提取蛋白,Western Blot檢測IκB,cJun,IRF3磷酸化情況。以cJun上游分子JNK的特異性抑制物SP600125和IκB通路的抑制物BA

16、Y7082阻斷cJun和NF-κB活化,實時定量PCR檢測Ifnb1表達。
　　 3.LPS預處理對DNA誘導基因表達譜的影響
　　 以LPS刺激BMDM細胞24h后,再轉(zhuǎn)染DNA,4h后提取RNA,質(zhì)檢合格后進行基因芯片檢測,對芯片結(jié)果進行分析驗證及機制探討。
　　 結(jié)果:
　　 1.LPS預處理對胞內(nèi)DNA產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素的影響
　　 2.LPS預處理抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的機制
　　 3

17、.LPS預處理對DNA誘導基因表達譜的影響
　　 結(jié)論:
　　 1.LPS預處理可顯著的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,說明TLR4通路的改變會影響到DNA免疫的水平。
　　 2.LPS可通過抑制DNA誘導的Ifnb1的啟動子活性而抑制其表達,從通路上主要是抑制轉(zhuǎn)錄因子IRF3和cJun而非IκB的磷酸化而實現(xiàn)的。
　　 3.LPS預處理并非抑制DNA免疫誘導的所有基因表達,部分基因甚至表達明顯上調(diào),這與LPS-LPS

18、耐受類似,但其表達譜又存在差別,說明其調(diào)控機制仍存在差別。
　　 4.LPS-DNA免疫所誘導的耐受基因受到IRF、Stat1等的調(diào)控,負性調(diào)控因子SOCS1的上調(diào)也是因為之一。
　　 創(chuàng)新點及意義:
　　 1.本研究首次探討了LPS對細胞內(nèi)DNA免疫的影響,有助于解釋臨床復合性感染的發(fā)病機制,并對于感染性疾病的治療,DNA疫苗的應用等均具有重要意義。
　　 2.首次從啟動子活性,轉(zhuǎn)錄因子水平及信號通路上