FcγRⅢa的基因多態(tài)性、血清中抗體及補(bǔ)體對利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對Raji細(xì)胞殺傷作用的影響.pdf

1、腫瘤特異性單克隆抗體(monoclonal antibody，MAb，簡稱單抗)是應(yīng)用雜交瘤技術(shù)針對腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原或特定的受體而制備出的MAb，可特異性識別腫瘤細(xì)胞抗原，選擇性地摧毀腫瘤細(xì)胞而健康細(xì)胞基本不受影響，為腫瘤患者的靶向免疫治療帶來了希望。針對特定腫瘤抗原的MAb殺傷腫瘤靶細(xì)胞的機(jī)理主要有三個(gè)方面：①抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicit

2、y，ADCC)溶解靶細(xì)胞；②通過補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(complement dependent cell cytotoxicity,CDC)；③直接和靶細(xì)胞結(jié)合促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 ADCC被證明是MAb臨床治療腫瘤的重要機(jī)制和手段。MAb首先通過抗原結(jié)合部位與靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)結(jié)合，再由效應(yīng)細(xì)胞上的FcγRⅢa識別其Fc段，介導(dǎo)ADCC作用。FcγRⅢa是唯一表達(dá)于NK細(xì)胞上可與IgG結(jié)合介導(dǎo)ADCC作用的Fc受體。FcγR

3、Ⅲa有三種基因型：FcγRⅢla-158F/F，F(xiàn)cγRⅢa-158V/V及FcγRⅢa-158V/F。FcγRⅢa的多態(tài)性可影響NK細(xì)胞及單核細(xì)胞的ADCC效能。有研究認(rèn)為FcγRⅢa-158V較FcγRⅢa-158F與人IgG結(jié)合具有更高的親和力，可更有效介導(dǎo)ADCC作用，而具有更好的治療效果。有研究報(bào)道FcγRⅢa-158V/V基因型病人，通過MAb治療的療效較FcγRⅢa-158V/F及FcγRⅢa-158F/F基因型病人好。<

4、br>　　 由于臨床使用的腫瘤特異性MAb非常昂貴，其介導(dǎo)的ADCC抗腫瘤治療的病人在治療期間由于化療所致的骨髓抑制、合并感染等原因，往往需靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)及血漿，上述治療所提供的血清抗體和補(bǔ)體對ADCC抗腫瘤效應(yīng)的影響尚不十分清楚，深入研究在腫瘤特異性MAb治療應(yīng)用過程中IVIG和血漿的配合應(yīng)用十分重要。
　　 本試驗(yàn)中嘗試使用nest-PCR的方法檢測出健康兒童及血液腫瘤患兒中FcγRⅢa的基因多態(tài)性的分布，

5、了解血液腫瘤患兒對MAb可能的療效反應(yīng)；通過體外實(shí)驗(yàn)用利妥昔單抗介導(dǎo)不同F(xiàn)cγRⅢa基因型的NK細(xì)胞對高表達(dá)CD20的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株(Raji細(xì)胞株)殺傷，確定不同F(xiàn)cγRⅢa基因型的NK細(xì)胞所介導(dǎo)ADCC效應(yīng)的差異；并通過增加補(bǔ)體及血清抗體的方式體外檢測它們對利妥昔單抗介導(dǎo)ADCC抗腫瘤作用影響。通過本研究希望對使用抗腫瘤特異性MAb的患者合理有效的應(yīng)用IVIG和血漿提供指導(dǎo)意見及實(shí)驗(yàn)依據(jù)；這對提高腫瘤特異性MAb的臨床療效和改善

6、腫瘤患者的生存率具重大意義。
　　 第一部分、正常兒童及血液腫瘤患兒中FcγRⅢa基因多態(tài)性分布。
　　 目的：檢測健康兒童及血液腫瘤患兒中FcγRⅢa的基因多態(tài)性的分布，了解血液腫瘤患兒對MAb可能的療效反應(yīng)。
　　 方法：
　　 1.按照DNA提取試劑盒從收集的外周血標(biāo)本中提取基因組DNA。
　　 2.巢式PCR(nest-PCR)擴(kuò)增FcγRⅢa基因：
　　 (1)外側(cè)PCR：外側(cè)正

7、義引物A為5'TGG CAA AGG CAG GAA GTA TT 3'，外側(cè)反義引物B為5'GCG TGT AAG AAT CAG GAA TCT C 3'，25μL，反應(yīng)體系包括DNA模板3μL，正反義引物A、B各2pmol，10 mmoL/L dNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶1.5u，10×PCR緩沖液2.5μL。35個(gè)PCR循環(huán)(95℃ 45S，64℃ 45S，72℃ 30S)。擴(kuò)增產(chǎn)物長度248 bp。
　　

8、(2)內(nèi)側(cè)PCR：內(nèi)側(cè)正義引物C為5'ATC AGA TTC GAT CCT ACT TCT GCAGGG GGC AT 3'，內(nèi)側(cè)反義引物D為5'ACG TGC TGA GCT TGA GTGATGGTG ATG TTC AC3'。25 μL反應(yīng)體系包括外側(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1μL，正反義引物C、D各025 pmol，10 mmol/L dNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶1.5u，10×PCR緩沖液2.5μL。35個(gè)PCR循環(huán)(95

9、℃ 45 S，65℃ 45 S，72℃ 30 S)。擴(kuò)增產(chǎn)物長度94bp。
　　 3.NlaⅢ酶切鑒定FcγRⅢa基因多態(tài)性：8μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)NlaⅢ內(nèi)切酶酶切，于37℃酶切過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)15％PAGE電泳分離DNA片段，銀染顯色。FcγRⅢa-158V/V純合型：PCR-RFLP后可得到61 bp和33 bp兩個(gè)片段。FcγRⅢa-158 V/F雜合型：PCR-RFLP后可得到94 bp、61 bp和33 bp共3個(gè)片段

10、。FcγRⅢa-158 F/F純合型：PCR-RFLP后仍為94bp大小的片段。
　　 4.統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，各組之間基因型分布差異及等位基因分布差異采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)α=0.05。
　　 結(jié)論：FcγRⅢa基因多態(tài)性在健康兒童及血液腫瘤患兒中的分布無明顯差異，均以FcγRⅢa-158V/F最多，F(xiàn)cγRⅢa-158V/V次之，F(xiàn)cγRⅢa-158F/F最少。
　　 第二部分、不

11、同F(xiàn)cγRⅢa基因型的NK細(xì)胞對Raji細(xì)胞的ADCC效應(yīng)的強(qiáng)度。
　　 目的：確定不同F(xiàn)cγRⅢa基因型的NK細(xì)胞所介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)差異。
　　 方法：
　　 1.效應(yīng)細(xì)胞分離：采用Ficoll-Hapaque分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，行ADCC實(shí)驗(yàn)前流式細(xì)胞術(shù)檢測其中CD3-CD56+的NK細(xì)胞的表達(dá)，以及NK細(xì)胞上FcγRⅢ的表達(dá)率。
　　 2.靶細(xì)胞培養(yǎng)：高表達(dá)CD20的Raji細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，行

12、ADCC實(shí)驗(yàn)前流式細(xì)胞術(shù)檢測其CD20表達(dá)率。
　　 3.抗體：以利妥昔單抗作為ADCC反應(yīng)抗體。
　　 4.確定利妥昔單抗在下列ADCC實(shí)驗(yàn)中的合適作用濃度：在預(yù)實(shí)驗(yàn)中選用的利妥昔單抗的濃度分別為10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml等依次遞增，與Raji細(xì)胞37℃作用30分鐘后行分別用流式細(xì)胞術(shù)檢測Raji上的CD20的表達(dá)，以其接近為零表達(dá)時(shí)的利妥昔單抗的濃度為最合適的作用濃

13、度。
　　 5.不同F(xiàn)cγRⅢa基因型的NK細(xì)胞的ADCC實(shí)驗(yàn)：取DIO標(biāo)記的Raji細(xì)胞作為靶細(xì)胞，與利妥昔單抗于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，再加入PBMNC作為效應(yīng)細(xì)胞，于體外37℃共孵育4小時(shí)，同樣再加入熒光標(biāo)記PI上流式細(xì)胞術(shù)檢測，計(jì)算細(xì)胞毒性指數(shù)。
　　 6.統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，ADCC結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Samples T Test)

14、，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)α=0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.在CD20+90％以上的Raji細(xì)胞1×106/ml中，30μg/ml的利妥昔單抗為最合適的體外實(shí)驗(yàn)作用濃度。
　　 2.FcγRⅢa基因多態(tài)性可影響利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對Raji細(xì)胞的體外ADCC效應(yīng)，以FcγRⅢa-158V/V基因型的NK細(xì)胞ADCC效應(yīng)最強(qiáng)，F(xiàn)cγRⅢa-158V/F基因型的NK細(xì)胞ADCC效應(yīng)次之。
　　 第三部分、血清抗體

15、及補(bǔ)體對利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對Raji細(xì)胞殺傷作用的影響。
　　 目的：體外檢測血清抗體及補(bǔ)體對利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對Raji細(xì)胞殺傷作用的影響。
　　 方法：
　　 1.效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞及反應(yīng)抗體均與第二部分相同。
　　 2.血清補(bǔ)體準(zhǔn)備：采外周血5ml于干燥無菌離心管中，斜放試管靜止30min后，2000rpm離心20min，用毛細(xì)吸管吸取上清(血清，含補(bǔ)體)-20℃冰箱保存，使用前與RPMI

16、1640培養(yǎng)液1∶1混合，制成含50％人血清(含補(bǔ)體)的培養(yǎng)基。
　　 3.血清抗體準(zhǔn)備：采用上述方法分離血清，56℃水浴恒溫箱30min滅活(其中補(bǔ)體失活，而抗體仍保持其活性)，-20℃冰箱保存，使用前與RPMI1640培養(yǎng)液2∶3混合，制成含40％人血清(含IgG)的培養(yǎng)基。
　　 4.在行殺傷實(shí)驗(yàn)前，檢測體外血清抗體對NK細(xì)胞上FcγRⅢa表達(dá)的影響。用含40％人血清(滅活后，含IgG約4.8mg/ml)的培養(yǎng)基將

17、PBMNC調(diào)成5×106/mL，取100μL，置于5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，拿出后PBS洗2次，流式細(xì)胞術(shù)檢測加入血清前后NK細(xì)胞上FcγRⅢa的表達(dá)。
　　 5.血清中抗體及補(bǔ)體對利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對Raji細(xì)胞殺傷作用實(shí)驗(yàn)：取DIO標(biāo)記的Raji細(xì)胞作為靶細(xì)胞，與利妥昔單抗(同時(shí)在血清抗體組加入40％人滅活血清)，于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，再加入PBMNC作為效應(yīng)細(xì)胞(同時(shí)在補(bǔ)體組加入50％人未滅

18、活血清)，于體外37℃共孵育4小時(shí)，再加入熒光標(biāo)記PI上流式細(xì)胞術(shù)檢測，計(jì)算細(xì)胞毒性指數(shù)。
　　 6.統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理， 殺傷結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用多因素方差分析和獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)α=0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.血清補(bǔ)體可增強(qiáng)利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對Raji細(xì)胞殺傷作用。
　　 2.血清抗體會減弱利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細(xì)胞對Raji細(xì)胞殺傷作用。