Tetherin蛋白對(duì)HBV復(fù)制及表達(dá)的下調(diào)作用.pdf

1、目的:構(gòu)建Tetherin真核表達(dá)質(zhì)粒，研究Tetherin蛋白在肝細(xì)胞中對(duì)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復(fù)制的影響及其作用機(jī)制，為抗HBV感染研究提供新的思路。
　　方法:PCR擴(kuò)增人源Tetherin基因，構(gòu)建Tetherin真核表達(dá)質(zhì)粒。用RT-PCR和Western blot的方法鑒定重組質(zhì)粒pTetherin-FLAG在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)。將質(zhì)粒pTetherin-FLAG轉(zhuǎn)染至HepG2

2、.2.15細(xì)胞，通過Southern blot、熒光定量PCR、ELISA、Western blot檢測手段，了解Tetherin對(duì)HBV復(fù)制的影響;加入對(duì)抗Tetherin作用的pVpu后，檢測HBV復(fù)制及表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證Tetherin對(duì)HBV的影響。
　　結(jié)果:通過酶切鑒定和DNA序列測定表明正確的將Tetherin基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1-3FLAG。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pTetherin-FLAG至HepG2細(xì)

3、胞后，RT-PCR和Western blot檢測到有Tetherin的表達(dá)。將pTetherin-FLAG轉(zhuǎn)染至HepG2.2.15細(xì)胞，Southern blot和熒光定量PCR結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)HBV DNA、HBV mRNA水平均顯著減少，ELISA結(jié)果表明細(xì)胞分泌HBsAg、 HBeAg顯著減少(P＜0.05)，Western blot結(jié)果顯示HBcAg蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。當(dāng)加入pVpu真核表達(dá)質(zhì)粒后，HBV的復(fù)制及表