替米沙坦對骨橋蛋白在單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎組織中表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitinal fibrosis，RIF)是多種腎臟疾病進(jìn)展的共同結(jié)局。研究發(fā)現(xiàn)在慢性腎臟疾病中腎小球?yàn)V過率減少與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，在慢性腎臟病的進(jìn)展過程中腎間質(zhì)纖維化扮演著極為重要的角色。 腎小管間質(zhì)損害的特征是炎細(xì)胞浸潤，而促進(jìn)炎細(xì)胞的浸潤的細(xì)胞因子尚未完全明了。巨噬細(xì)胞是炎癥細(xì)胞，它的聚集程度與隨后相應(yīng)部位的纖維化程度密切相關(guān)，是啟動(dòng)腎間質(zhì)纖維化病變的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)

2、，而骨橋蛋白(OPN)是吸引腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞最重要的趨化因子，其表達(dá)量與間質(zhì)炎癥和纖維化程度密切相關(guān)。OPN不但趨化循環(huán)中的單核巨噬細(xì)胞到腎小管間質(zhì)，而且直接刺激腎固有細(xì)胞如腎小管上皮細(xì)胞，啟動(dòng)或擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致腎小管變性損傷，繼而。腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化、腎小管萎縮消失。研究發(fā)現(xiàn)在腎小管最初受損時(shí)，OPN還可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞再生和重建，幫助其功能的恢復(fù)，但隨著病情的發(fā)展，病變逐漸嚴(yán)重，這種作用失代償。由此可推斷通過局部阻斷

3、OPN因子，抑制單核巨噬細(xì)胞在腎間質(zhì)的聚集與增殖，可達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)，減輕腎小管損傷、抑制纖維化的目的。 替米沙坦是一種新型血管緊張素Ⅱ1型受體(AT<,1>R)拮抗劑，在腎臟疾病治療中具有降低血壓、減少蛋白尿、保護(hù)腎功能的作用。目前尚未檢索到替米沙坦對于OPN的調(diào)節(jié)作用。本課題擬通過輸尿管結(jié)扎建立大鼠腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型，研究OPN及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)在腎間質(zhì)纖維化時(shí)的表達(dá)，從細(xì)胞因子水平探討替米沙坦減輕腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞

4、的浸潤及間質(zhì)纖維化。探討替米沙坦抗間質(zhì)纖維化，延緩腎臟病變進(jìn)展，保護(hù)腎功能的機(jī)制。 方法： 選擇清潔級健康雄性SD大鼠72只，體重(210±10)克，隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(A組n=24)，輸尿管結(jié)扎組(B組n-24)，替米沙坦(美卡素勃林格殷格翰BoehringerIngelheim制造)治療組(C組n=24)。將各組大鼠以水合氯醛(0.1ml/kg)腹腔注射麻醉后，行左側(cè)恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左側(cè)輸尿管，在中上

5、1/3處用4號線上下結(jié)扎兩處，然后從中剪斷輸尿管，以防逆行性感染，A組除不結(jié)扎和剪斷輸尿管外，其他手術(shù)過程同前。術(shù)后各組大鼠均正常飲食。A組和B組大鼠用生理鹽水2ml灌胃，1次/日；C組大鼠以美卡素混懸液27mg/kg/d灌胃，1次/日。三組均于術(shù)前一天開始灌胃至術(shù)后第1、4、7、14d每組大鼠各取6只處死，快速取出左腎，按冠狀位縱形切開，取腎組織的1/2置于10％福爾馬林固定液固定，酒精逐級脫水，二甲苯透明石蠟包埋，制成5um切片。在

6、第14天處死大鼠時(shí)收集3ml血標(biāo)本及處死前24h尿液.24h尿送檢尿肌酐、尿蛋白，血標(biāo)本送檢肌酐.光鏡HE染色觀察腎臟病理變化。采用免疫組織化學(xué)染色測定腎間質(zhì)OPN、腎小管上皮細(xì)胞PCNA的表達(dá)及腎間質(zhì)單核巨噬細(xì)胞數(shù)的變化，結(jié)果應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析，應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7、 結(jié)果：各組大鼠生化檢查結(jié)果，與A組相比，B組及C組大鼠肌酐清除率(CCR)、24h尿蛋白定量均無明顯變化。光鏡下觀察，HE染色A組未見異常。HE染色可見B組及C組各時(shí)相點(diǎn)大鼠腎臟腎小球均無明顯變化。B組術(shù)后3天腎小管擴(kuò)張不明顯，可見腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞局灶浸潤，腎間質(zhì)寬度增加；第7天腎小管擴(kuò)張明顯，上皮細(xì)胞變性、水腫、甚至壞死，腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)寬度明顯增加，偶見萎縮腎小管；第14天上述病變加重，可見彌漫的腎小管基底膜增厚皺縮，小

8、管基底膜不同程度斷裂，皮質(zhì)及外髓萎縮的腎小管較多，間質(zhì)中大量淋巴單核細(xì)胞浸潤，纖維化較明顯。 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示： ①OPN在A組腎組織的亨利氏襻升支粗段、遠(yuǎn)曲小管、集合管均有少量持續(xù)表達(dá)，而在腎小球內(nèi)基本無表達(dá)。B組大鼠梗阻側(cè)腎小管一間質(zhì)中OPN表達(dá)較A組明顯增加(P<0.05)且于術(shù)后第4d達(dá)高峰，OPN主要分布在腎小管上皮細(xì)胞胞漿及腎小管上皮刷狀緣，部分間質(zhì)細(xì)胞亦有表達(dá)；C組大鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)腎小管一間質(zhì)OPN表

9、達(dá)均明顯低于B組，但仍高于A組(P<0.05，P<0.05)。 ②PCNA在腎小管上皮細(xì)胞核表達(dá)。A組在整個(gè)過程中腎小管細(xì)胞只有低度增殖活動(dòng)。B組腎小管PCNA表達(dá)第4d時(shí)已升至高峰，隨后下降，14d時(shí)已低于A組。C組腎小管同樣存在增殖，PCNA表達(dá)較B組高(P<0.05)。腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞的浸潤：A組各時(shí)期偶可見到巨噬細(xì)胞的浸潤。B組術(shù)后第3天可見少量巨噬細(xì)胞浸潤，第7天可見多量巨噬細(xì)胞浸潤，第14天有所減少，均高于A組(P<0

10、.05)。C組與A組同時(shí)期相比巨噬細(xì)胞均升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。C組與B組同時(shí)相相比巨噬細(xì)胞數(shù)無明顯減少，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。相關(guān)分析：OPN的表達(dá)與腎小管一間質(zhì)ED-1陽性細(xì)胞數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)呈正相關(guān)(r=0.9852，0.9037，0.9298，0.9859，均P<0.05)。 結(jié)論： 隨單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠病情的進(jìn)展，腎小管間質(zhì)OPN表達(dá)增多，可能在腎間質(zhì)纖維化中起重要作用。OPN可能通過介導(dǎo)巨