NGAL在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織中的表達(dá).pdf

1、研究背景：
　　 研究顯示腎間質(zhì)病變與慢性腎功能衰竭進(jìn)展關(guān)系密切,腎間質(zhì)纖維化幾乎是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)。研究其病理過程和發(fā)生機(jī)制,尋找延緩和阻斷腎纖維化新靶標(biāo),是目前國內(nèi)外腎臟病研究的熱點(diǎn)方向。多種細(xì)胞因子和生物活性物質(zhì)參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)生發(fā)展過程,各調(diào)節(jié)因子通過生物信號傳導(dǎo)機(jī)制聯(lián)系起來,形成完善的調(diào)節(jié)反饋系統(tǒng),調(diào)節(jié)機(jī)體的病理生理過程。
　　 腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程較為復(fù)雜,主要

2、包括成纖維細(xì)胞活化、增殖及表型轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)變?yōu)榉置讦?平滑肌肌動(dòng)蛋白的肌成纖維細(xì)胞,生成細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluarmatrix,ECM)的能力明顯增強(qiáng),在多種細(xì)胞因子作用、炎癥細(xì)胞浸潤等因素調(diào)節(jié)下,造成ECM生成/降解平衡失調(diào),ECM大量積聚,從而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。在該病理過程中,有多種細(xì)胞因子參與,其中促進(jìn)纖維化的因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、血小板源性生長因子(PDGF)等,抑

3、制纖維化的因子包括:肝細(xì)胞生長因子(HGF)、核心蛋白多糖(Decorin)、骨形態(tài)形成蛋白-7(BMP-7)等。在眾多促纖維化的因子中,TGF-β1被認(rèn)為是最重要的促纖維化因子,很多研究試圖通過抑制TGF-β1阻止腎纖維化進(jìn)展。然而,要將其研究應(yīng)用于臨床尚有很多問題需要解決,例如,目前的方法還很難在人體腎臟產(chǎn)生顯著反義抑制TGF-β1表達(dá)的寡義核苷酸來抑制TGF-β1的表達(dá)；且TGF-β1也是一種抗炎因子,長期抑制TGF-β1易誘發(fā)炎

4、癥反應(yīng),研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1基因敲除的小鼠可死于多發(fā)性炎癥。因此尋找抑制腎間質(zhì)的纖維化進(jìn)程的更特異性的藥物作用靶點(diǎn),在治療腎臟纖維化中具有重要意義。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是降解ECM的重要酶系,MMPs主要有兩方面功能,一是降解全部ECM成分,二是激活其他MMPs,形成級聯(lián)效應(yīng)。MMPs均以酶原的形式分泌到ECM中,在激活劑作用下脫去前肽產(chǎn)生具有生物活性的MMPs發(fā)

5、揮生物效能?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissueinhibitor of metalloproteinase,TIMPs)可抑制MMPs酶原及酶活性,對調(diào)節(jié)ECM形成/降解具有重要作用。腎小管間質(zhì)纖維化主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型間質(zhì)膠原及Ⅳ型膜膠原、糖蛋白和蛋白多糖的堆積,MMPs/TIMPs平衡失調(diào)腎間質(zhì)纖維化發(fā)病的關(guān)鍵,而MMP-9/TIMP-1為其中最重要的一對。TIMP-1可與MMP-9前體(pro-MMP-9)形成穩(wěn)定的復(fù)合體,阻礙

6、pro-MMP-9的自我激活；同時(shí)TIMP-1抑制已活化的MMP-9的活性,直接與活化的MMP-9 Zn2+活性中心按1:1比例發(fā)生不可逆結(jié)合,阻斷或抑制MMP-9活性,而MMP-9活性高低直接影響腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。在不同病因所致的腎間質(zhì)纖維化病程發(fā)展中均存在MMPs/TIMPs的功能紊亂。不同實(shí)驗(yàn)方法觀察可有不同的結(jié)果,但有一種共同趨勢,即TIMPs高表達(dá),和(或)MMPs的活性下降。尋找MMPs激活劑或表達(dá)促進(jìn)劑或者TIMPs的抑

7、制劑,有可能成為預(yù)防和治療腎間質(zhì)纖維化的新方法。
　　 中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白,英文名稱為Neutrophilgelatinase-associated lipocalin(NGAL),又稱為lipocalin-2,是lipocalin家族新成員,是1993年K Jeldsen在中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種小分子量分泌性蛋白。NGAL除具有l(wèi)ipocalin家族共有疏水基結(jié)構(gòu)外,尚存在一游離的巰基,可與MMP-9前體等其他分

8、子結(jié)合,為其發(fā)揮特殊的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。NGAL在人體表達(dá)于多種組織器官,如:支氣管、胃、小腸、腎臟、前列腺、胸腺等。NGAL具有參與炎癥趨化與免疫應(yīng)答反應(yīng)；參與腎小管上皮細(xì)胞的形成、修復(fù)；參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展等多種生物學(xué)作用。
　　 研究發(fā)現(xiàn)NGAL對調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1具有一定作用。NGAL可結(jié)合于MMP-9上保護(hù)MMP-9不被降解。一般情況下,MMP-9是以Pro-MMP-9形式貯存于細(xì)胞內(nèi),分泌到細(xì)胞外之后,只

9、有切去N端的一段序列,MMP-9才表現(xiàn)活性。通常,Pro-MMP-9在細(xì)胞內(nèi)主要以四種方式存在:單體、同源二聚體、NGAL與Pro-MMP-9以分子間二硫鍵結(jié)合形成的異源二聚體(NGAL/Pro-MMP-9)以及此異源二聚體與金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)形成的三元復(fù)合物NGAL/Pro-MMP-9/TIMP-1。在這種三元復(fù)合物中,Pro-MMP-9仍可被激活為有活性的MMP-9,但活性會(huì)有所降低。然而當(dāng)此三元復(fù)合物中的TI

10、MP-1通過它的游離N-端結(jié)構(gòu)域去結(jié)合和抑制其它的MMPs時(shí),又可形成NGAL/Pro-MMP-9/TIMP-1/MMPs四元復(fù)合物。而當(dāng)這種四元復(fù)合物被活化時(shí),Pro-MMP-9被激活成MMP-9的活性反而比三元復(fù)合物時(shí)的活性高許多倍。很顯然NGAL明顯具有調(diào)節(jié)這些復(fù)合物的能力,甚至從某種程度上來講,NGAL具有抵消復(fù)合物中TIMP-1抑制MMP-9活性的作用。故通過探討NGAL在腎間質(zhì)纖維化模型中表達(dá)情況及與,對于探索其在腎間質(zhì)纖維

11、化中的作用機(jī)制及為治療腎間質(zhì)纖維化可能提供新思路。
　　 研究發(fā)現(xiàn)急性藥物相關(guān)性腎炎患者腎組織中NGAL在近端小管的表達(dá)較正常人增強(qiáng),NGAL表達(dá)量與間質(zhì)-小管損害呈負(fù)相關(guān),說明NGAL在急性腎小管間質(zhì)損傷中起到一定保護(hù)作用,但具體機(jī)制尚不明確,推測NGAL可能在腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮一定作用。Jaya Mishra在急性小鼠急性缺血-再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn),予NGAL治療可顯著減少小管細(xì)胞組織病理學(xué)損傷,增加近端小管數(shù)目,推測NGA

12、L可能誘導(dǎo)腎間質(zhì)細(xì)胞向小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換而誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞再生。
　　 目前國內(nèi)外對NGAL研究多集中于其在乳腺癌等腫瘤發(fā)生機(jī)制中的作用及在腎臟急性缺血-再灌注損傷、腎移植及心肺分流術(shù)等多種因素誘發(fā)的急性腎功能損害的早期檢測指標(biāo)等。對于NGAL在腎間質(zhì)纖維化中的作用研究較少,以上研究均證明NGAL,在腎間質(zhì)纖維化過程中可能起到一定的調(diào)節(jié)作用,故探討NGAL在腎間質(zhì)纖維化模型中表達(dá)情況及作用,對于探索其在腎間質(zhì)纖維化中的作用機(jī)制及

13、為治療腎間質(zhì)纖維化可能提供新思路。
　　 研究目的：
　　 1、動(dòng)態(tài)觀測單側(cè)輸尿管梗阻大鼠梗阻側(cè)腎組織NGAL、MMP-9及TIMP-1的表達(dá)變化,探討NGAL與MMP-9、TIMP-1在腎纖維化發(fā)展過程中的相關(guān)關(guān)系；
　　 2、探討NGAL在腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　 研究方法
　　 1、制作單側(cè)輸尿管梗阻模型
　　 將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為單側(cè)輸尿管梗阻組(UUO)及

14、假手術(shù)組(SOR),UUO組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù),SOR組僅游離左側(cè)輸尿管不結(jié)扎。術(shù)后第1、4、7、14天分別處死每組中的6只大鼠,取左腎(梗阻側(cè)腎臟)行HE和Masson染色。
　　 2、用免疫組化ELiVisionTMplus法檢測腎組織NGAL、MMP-9、TIMP-1及FN的表達(dá)情況。
　　 3、用SPSS13.0對結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果
　　 1、HE、MASSON染色評估腎纖維化程度

15、r>　　 UUO組第1天遠(yuǎn)端小管無擴(kuò)張,腎間質(zhì)無明顯水腫；術(shù)后第4天遠(yuǎn)端小管擴(kuò)張,腎間質(zhì)輕度水腫,間質(zhì)內(nèi)散在淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤；術(shù)后第7天遠(yuǎn)端小管擴(kuò)張明顯,腎間質(zhì)明顯水腫,近端小管出現(xiàn)擴(kuò)張,炎性細(xì)胞浸潤進(jìn)行性加重并伴有纖維細(xì)胞增生；術(shù)后第14天可見腎小管、集合管擴(kuò)張呈囊狀,部分上皮細(xì)胞變性、壞死,腎小管結(jié)構(gòu)破壞,管腔塌陷,炎性細(xì)胞浸潤。
　　 2、FN免疫組化結(jié)果
　　 SOR組大鼠FN在腎小球、腎小管基底膜及腎間

16、質(zhì)有少許表達(dá),UUO組隨輸尿管梗阻時(shí)間延長,FN在腎間質(zhì)表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05),在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均高于對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的SOR組(P<0.05)。
　　 3、NGAL免疫組化結(jié)果
　　 SOR組大鼠NGAL在腎近端小管有一定量表達(dá),遠(yuǎn)端小管、集合管上皮細(xì)胞等部位表達(dá)陰性。UUO組NGAL腎間質(zhì)纖維化病程早期表達(dá)明顯增強(qiáng)(第1、4天),隨梗阻時(shí)間延長,病程發(fā)展,NGAL表達(dá)強(qiáng)度有所減弱,但仍高于SOR組。
　　 4、

17、MMP-9免疫組化結(jié)果
　　 SOR組大鼠MMP-9在腎近端小管上皮細(xì)胞有一定量表達(dá),隨著梗阻時(shí)間的延長,UUO組MMP-9表達(dá)逐漸增多,UUO組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)MMP-9表達(dá)顯著高于對應(yīng)的SOR組,術(shù)后第4、7天明顯高于前一時(shí)間點(diǎn)(P<0.05),而從第7天到第14天有所下降(P<0.05)。
　　 5、TIMP-1免疫組化結(jié)果
　　 SOR組大鼠TIMP-1在腎小球、血管內(nèi)皮及腎小管間質(zhì)有少量表達(dá),隨著梗阻時(shí)間的

18、延長,UUO組TIMP-1表達(dá)逐漸增多(P<0.05),UUO組術(shù)后術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)TIMP-1表達(dá)陽性程度明顯高于對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的SOR組(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 NGAL的表達(dá)在腎間質(zhì)纖維化早期明顯增強(qiáng),與腎間質(zhì)損傷指數(shù)和纖維化程度呈顯著負(fù)相關(guān),提示其參與抑制腎間質(zhì)纖維化病程的進(jìn)展:與MMP/TIMP比值呈正相關(guān),提示NGAL可能通過調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)ECM生成/降解平衡,從而延緩腎間質(zhì)纖