低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞及Cx43的影響與機(jī)制的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景和目的
　　隨著科技的飛速發(fā)展,電磁輻射的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,各種通訊、網(wǎng)絡(luò)、醫(yī)療設(shè)備與人的關(guān)系愈加密切,磁場(chǎng)的作用逐漸受到人們的重視,研究顯示電磁輻射對(duì)人體產(chǎn)生損傷作用,相反也有研究顯示電磁輻射可以作為一種安全有效的物理治療手段,這些不同的結(jié)果,取決于電磁輻射的強(qiáng)度、頻率、時(shí)間等。據(jù)報(bào)導(dǎo),缺血性心臟病近幾年來(lái)的發(fā)病率死亡率呈逐年上升的趨勢(shì),已成為威脅人類健康和生命的頭號(hào)殺手[1]。缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展與心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的

2、功能受損密切相關(guān)。因而促進(jìn)內(nèi)皮的再生是治療缺血性心臟病的主要手段。微血管內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞在功能上有相似之處,它參與血管的再生,對(duì)改善治療心血管疾病起到重要的作用。而細(xì)胞縫隙連接蛋白43(connexin43,Cx43)與微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、遷移、炎癥反應(yīng)等關(guān)系密切,甚至被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)生的標(biāo)志性蛋白之一[2]。因此我們可以尋找一種安全有效的電磁輻射條件,在這種條件下能夠促進(jìn)微血管內(nèi)皮的再生,使新的血管生成,進(jìn)而來(lái)治療缺血性

3、心臟病。本課題擬以大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象,旨在研究低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞和Cx43蛋白表達(dá)的影響。進(jìn)一步探討低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制,從而為臨床選擇合適的磁場(chǎng)治療條件治療缺血性心臟病提供理論依據(jù)和參考。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.SD成年大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng),采用胰酶、膠原酶消化培養(yǎng),差速貼壁法純化細(xì)胞,鏡下觀察并對(duì)細(xì)胞表達(dá)特異蛋白VIII因子和vWF進(jìn)行檢測(cè),吞噬實(shí)

4、驗(yàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定,并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CMECs純度。
　　2.對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行低頻脈沖磁場(chǎng)照射,將細(xì)胞分為對(duì)照組與照射組,輻照時(shí)間:4h/d,連續(xù)照射7d,頻率:15Hz,場(chǎng)強(qiáng)分別為:0.8mT、1.4mT、1.8mT。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;流式技術(shù)檢測(cè)不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖周期變化情況;用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法檢測(cè)不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力。
　　3.用

5、實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Cx43mRNA含量變化。采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中縫隙連接蛋白Cx43蛋白含量變化,采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞MAPK通路中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白的含量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.成功培養(yǎng)并純化原代心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞。分離純化后鏡下觀察細(xì)胞呈現(xiàn)鋪路石樣特性。CMECs中特異蛋白VIII因子和vW

6、F檢測(cè)呈陽(yáng)性,吞噬Dil-Ac-LDL的CMECs成紅色顯影,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CMECs純度為97.27±0.83％。
　　2.1.4mT、1.8mT低頻電磁脈沖磁場(chǎng)可提高細(xì)胞的增殖水平,促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入到G2期、S期,促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲能力,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),1.8mT可以促進(jìn)細(xì)胞分泌NO,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),1.4mT對(duì)細(xì)胞分泌NO的影響與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。0.8mT低

7、頻電磁脈沖磁場(chǎng)處理后細(xì)胞增殖情況、增殖周期、遷移和侵襲能力的改變及NO的分泌與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　3.1.4mT、1.8mT低頻電磁脈沖磁場(chǎng)提高Cx43蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,提高ERK、p-ERK蛋白的水平,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),JNK、p-JNK蛋白的水平,與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。0.8mT低頻電磁脈沖磁場(chǎng)處理后細(xì)胞Cx43蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,ERK、p-

8、ERK、JNK、p-JNK蛋白的水平與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.低頻脈沖磁場(chǎng)可以提高心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力,促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入到G2期、S期,使細(xì)胞DNA合成增多;促進(jìn)細(xì)胞的遷移能力、侵襲能力;刺激細(xì)胞分泌NO。
　　2.低頻脈沖磁場(chǎng)可以提高Cx43的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平,增加MAPK通路ERK、p-ERK蛋白的表達(dá),推測(cè)低頻脈沖磁場(chǎng)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生物能