膽紅素對肝肺綜合征大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的研究.pdf

1、背景和目的:
　　肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是肝病所引起的肺部并發(fā)癥,主要由慢性肝病或者門脈高壓引起,臨床癥狀主要表現(xiàn)為:肺內(nèi)微血管異常擴(kuò)張、氣體交換障礙、動(dòng)脈血氧合作用異常。目前,國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為:導(dǎo)致HPS的發(fā)生發(fā)展主要因?yàn)榉挝⒀艿漠惓U(kuò)張并同時(shí)存在血液的異常分流,而這些原因最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生了嚴(yán)重的低氧血癥。很難糾正的低氧血癥是HPS死亡率高的根本原因。肝移植是目前唯一有效的治療方法

2、。目前的研究認(rèn)為:肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)的異常增殖是引起肺微血管擴(kuò)張的主要原因。同時(shí),我們前期研究中發(fā)現(xiàn):結(jié)扎大鼠的膽總管(common bile duct ligation, CBDL)五周后,肺微血管管壁出現(xiàn)了顯著地增粗增厚;離體培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞在HPS大鼠血清的刺激下呈現(xiàn)復(fù)層生長(TGF-β1/Smad3、PI3K/Akt1異常增

3、高)。由于HPS大鼠血清里含有膽紅素,并且利用CBDL法建立HPS模型過程中,大鼠血液中的膽紅素濃度也是顯著增高的。為此,膽紅素對肝肺綜合征PMVECs具有怎樣的影響值得研究,并且國內(nèi)外還沒有膽紅素對肝肺綜合征PMVECs影響研究的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用CBDL構(gòu)建大鼠模型,培養(yǎng)原代PMVECs,不同濃度膽紅素刺激PMVECs,再通過蛋白印跡法(Western Blot)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction

4、,PCR)、細(xì)胞增殖(Cell Counting Kit-8,CCK-8;3H-TdR摻入法)等實(shí)驗(yàn)方法,檢測大鼠在形成肝肺綜合征過程中肺組織和不同濃度膽紅素刺激下 PMVECs相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,來探討HPS發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法分兩部分:
　　1.肺組織Akt1和Smad3在大鼠肝肺綜合征形成中的作用研究
　　1.1.采用膽總管結(jié)扎法構(gòu)建大鼠模型,分為對照組(C組)、假手術(shù)組(S組)、實(shí)驗(yàn)組(CBDL組),

5、分別在1W、3W、5W時(shí),行肝、肺病理切片和血?dú)夥治觥?br>　　1.2.利用RT-PCR和Western Blot法,分別檢測C組、S組、CBDL組,在1W、3W、5W時(shí)肺組織Akt1、Smad3表達(dá)變化。
　　2.膽紅素對PMVECs影響的研究
　　2.1.大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　2.2.PMVECs隨機(jī)分五組,對照組、B1組(5μmol膽紅素)、B2組(10μmol膽紅素)、B3組(20μmo

6、l膽紅素)、B4組(50μmol膽紅素),利用RT-PCR和Western Blot法,分別檢測24h、48h、72h時(shí)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Akt1、Smad3表達(dá)變化;利用CCK-8和3H-TdR摻入法,分別檢測24h、48h、72h時(shí)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果:
　　1. CBDL5W時(shí)肺微血管明顯擴(kuò)張,肺泡-動(dòng)脈血氧分壓差增大(P<0.05);與C組和S組比較,CBDL組3W、5W時(shí)肺組織Akt1、Smad3的

7、 mRNA及其蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05),并且CBDL5W比3W表達(dá)更顯著(P<0.05)。
　　2.48h,B4組PMVECs增殖明顯減弱,Akt1、Smad3蛋白及其mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05);72h,B3組、B4組PMVECs增殖明顯減弱,Akt1、Smad3蛋白及其mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05);B4組與B3組比較,B4組PMVECs增殖減弱更明顯, Akt1、Smad3蛋白及其mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P<