辛伐他汀對(duì)雷帕霉素作用下的大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景和目的：冠心病(CHD)是心血管疾病中最常見、最重要的一種。它作為危害人類健康的“第一殺手”,已波及全球,成為許多發(fā)達(dá)國家的主要災(zāi)難。冠心病發(fā)病實(shí)質(zhì)是心肌缺血,即冠狀動(dòng)脈管腔不同程度的狹窄或阻塞而造成心肌缺血、缺氧,從而發(fā)生一系列的臨床癥狀(如胸悶、心絞痛),甚至發(fā)生心肌梗死危機(jī)生命。因此,保持血管通暢,保證心肌血供是治療關(guān)鍵。現(xiàn)今冠心病的治療可分為藥物治療、內(nèi)科介入治療和外科搭橋治療三種,其中介入和藥物聯(lián)合治療是主要的治療手段

2、。介入治療開始應(yīng)用至今已經(jīng)有超過30年的歷史,技術(shù)已較成熟并成為冠心病治療的主要手段。目前,藥物涂層支架(DES)已代替最初的金屬裸支架(BMS)占據(jù)著介入治療主要市場(chǎng)。以雷帕霉素(RAPA)涂層支架為例,其植入后通過特別控制支架聚合涂層,在血管內(nèi)釋放雷帕霉素這種抗腫瘤藥物,抑制血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞增殖遷移,從而達(dá)到降低再狹窄率的目的。除此以外,長期的藥物治療是冠心病患者治療的基礎(chǔ)。他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶

3、抑制劑,是治療冠心病的常規(guī)用藥。同時(shí),他汀是一類多效型的藥物,除了降低血脂作用外,還能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移,誘導(dǎo)一氧化氮(NO)的合成和釋放,抑制細(xì)胞凋亡和抗炎等作用。本實(shí)驗(yàn)以辛伐他汀(SIM)為例,以對(duì)心臟物質(zhì)交換有著重要地位的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)為研究對(duì)象,觀察藥物支架植入后,辛伐他汀與雷帕霉素共同作用下的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法：第一部分:RAPA對(duì)CMECs的影響1.酶消化法體外培養(yǎng)大鼠C

4、MECs,取第2-3代細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。2.CMECs完全隨機(jī)分為5組并加入不同濃度的RAPA,分別為對(duì)照組、0.01μg/L組、0.1μg/L組、1μg/L組及10μg/L組。干擾時(shí)間為24h。3.用MTT法檢測(cè)CMECs的增殖情況,用transwell法檢測(cè)CMECs的遷移能力。4.選擇合適的RAPA干擾濃度(抑制增殖與遷移能力居中)。
　　第二部分:SIM對(duì)RAPA作用下CMECs的影響1.CMECs隨機(jī)分為4個(gè)大組,分別

5、為對(duì)照組,SIM組,RAPA組和SIM+RAPA組。其中SIM+RAPA組又分為RAPA(1μg/L)+SIM(0.01μmol/L)組、RAPA(1μg/L)+SIM(0.1μmol/L)組、RAPA(1μg/L)+SIM(1μmol/L)組、RAPA(1μg/L)+SIM(10μmol/L)組。干擾時(shí)間為24小時(shí)。2.分別用MTT和transwell法檢測(cè)各組增殖和遷移能力;用Hoechs(t33258)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;用NO

6、分泌活性的Griess反應(yīng)試劑盒檢測(cè)NO的合成和分泌。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.體外成功培養(yǎng)有內(nèi)皮細(xì)胞特征的CMECs。2.RAPA能顯著抑制CMECs的增殖與遷移能力,并呈濃度依賴性,即濃度越高,其抑制能力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)選取1μg/L作為基礎(chǔ)濃度,進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。3.單獨(dú)的SIM組(1μmol/L)能促進(jìn)CMECs的增殖和遷移能力,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)NO的合成和分泌。4.將不同濃度的SIM加入RAPA(1μg/L)后,能改善RAPA對(duì)細(xì)

7、胞增殖和遷移的抑制作用,對(duì)增殖和遷移的抑制改善最明顯濃度分別出現(xiàn)在1μmol/L和0.1μmol/L。然而,改善最明顯濃度均不出現(xiàn)在10μmol/L,SIM在1μg/L及以下的濃度,對(duì)RAPA抑制的改善作用呈濃度依賴性,即濃度越高,改善作用越明顯;在1μg/L以上的濃度改善作用不顯著。5.單獨(dú)的RAPA使CMECs的凋亡率升高,加入SIM后能抑制其誘導(dǎo)凋亡的作用,抑制最明顯的濃度出現(xiàn)在1μg/L。6.RAPA能抑制CMECs的NO合成與

8、分泌,SIM能改善其抑制作用。
　　結(jié)論：RAPA為一種抗腫瘤藥物,能夠顯著抑制CMECs的增殖和遷移,并呈濃度依賴性。除此以外,它還能誘導(dǎo)CMECs的凋亡,抑制CMECs的NO合成和分泌,對(duì)CMECs有一定的損傷作用。SIM(1μmol/L)能促進(jìn)CMECs的增殖和遷移,抑制凋亡,促進(jìn)NO的合成和分泌。在RAPA干擾的CMECs中加入不同濃度的SIM共孵育24h,可以改善RAPA的抑制作用,降低凋亡率,從而抑制其對(duì)CMECs的損