右旋美托咪啶引起腦內星形膠質細胞EGFR間接激活.pdf

1、右旋美托咪啶(Dexmedetomidine)是α2-腎上腺素能受體激動劑，它與α2-腎上腺素能受體特異性結合的能力是與α1-腎上腺素能受體結合的1600倍，也比可樂定高出幾倍。右旋美托咪啶除了有鎮(zhèn)靜催眠作用外，在實驗中還發(fā)現(xiàn)腦缺血后，低濃度的右旋美托咪啶具有神經(jīng)保護作用。這可能與它能激活Gi/o蛋白偶聯(lián)受體結合的α2-腎上腺素能受體有關。 目前研究表明，在原代培養(yǎng)的星形膠質細胞中，α2-腎上腺素能受體激動劑右旋美托咪啶(Dex

2、medetomidine)通過上皮生長因子受體(EGFR，epidermalgrowthfactorreceptor)間接激活引起細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)磷酸化，此間接激活途徑能被金屬蛋白酶抑制劑GM6001和EGFR抑制劑AG1478所抑制。本實驗主要研究兩個問題：(1)α2-腎上腺素能受體激動劑是否在整體動物腦組織和腦片上引起與在星形膠質細胞EGFR間接激活相似的信號傳導途徑；(2)α2-腎上腺素能受體激動劑在神經(jīng)元上是否引起E

3、GFR間接激活的信號傳導途徑。 方法采用整體動物腹腔注射藥物、腦片培養(yǎng)及原代培養(yǎng)神經(jīng)元方法。整體動物腹腔注射右旋美托咪啶，7min或15min后斷頭，取出腦組織在裂解液中勻漿；腦片培養(yǎng)2h后，培養(yǎng)液里分別加入AG1478、GM6001、阿替美唑或肝素其中一種抑制劑孵育，在培養(yǎng)箱中孵育15min，然后加入50nM右旋美托咪啶，孵育20min后。在裂解液中勻漿；原代培養(yǎng)7d的神經(jīng)元，對照組和DEX組分別加入PBS和50nM右旋美托咪

4、啶，在37℃的培養(yǎng)箱中孵育20min，加入裂解液，收集細胞。勻漿后的樣品進行免疫凝膠電泳和Western印跡法半定量測定ERK1/2磷酸化。使用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組資料用one-wayANOVA方法進行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。 實驗結果1、整體動物：7min后在DEX組ERK1/2磷酸化比對照組有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。注射右旋美托咪啶15min后，DEX組ERK1/2

5、磷酸化高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 2、腦片：右旋美托咪啶濃度曲線，右旋美托咪啶在25nM時ERK1/2磷酸化只有輕度升高，差異較對照組無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。而在50nM和100nM時ERK1/2磷酸化有顯著升高，差異較對照組具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。金屬蛋白酶抑制劑GM6001存在時，DEX+GM6001組ERK1/2磷酸化明顯低于DEX組，并且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表明右旋美托

6、咪啶引起ERK1/2磷酸化可以被GM6001所抑制。EGFR抑制劑AG1478存在時DEX+AG1478組ERK1/2磷酸化明顯低于DEX組。并且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明右旋美托咪啶引起ERKi/2磷酸化可以被AG1478所抑制。HB-EGF拮抗劑肝素存在時DEX+肝素組ERK1/2磷酸化明顯低于DEX組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表明右旋美托咪啶引起ERK1/2磷酸化可被肝素抑制。α2-腎上腺素能受體抑制劑阿

7、替美唑存在時DEX+阿替美唑組ERK1/2磷酸化明顯低于DEX組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表明右旋美托咪啶引起的ERK1/2磷酸化可被阿替美唑所抑制。 3、神經(jīng)元：與在腦片觀察到的結果相反，右旋美托咪啶在原代培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元上沒有引起ERK1/2磷酸化的變化(P＞0.05)。 討論金屬蛋白酶抑制劑GM6001、EGFR抑制劑AG1478、HB-EGF拮抗劑肝素均能抑制右旋美托咪啶引起的ERK1/2磷酸化，

8、這說明右旋美托咪啶引起的ERK1/2磷酸化是由于HB-EGF的脫落和EGFR的激活。國內外尚無在整體動物和離體腦片為研究對象進行EGFR間接激活的研究。肝素抑制實驗結果表明，HB-EGF是被釋放的EGFR配體之一。但并不能說明只有HB-EGF一種配體被釋放。EGFR至少可以被6種配體激活，它們分別是EGF、HB-EGF、轉化生長因子-α、雙調蛋白、β-細胞素、表皮調節(jié)素。在腦組織最初發(fā)育階段，HB-EGF表達水平高，此后下降。但是有人發(fā)

9、現(xiàn)HB-EGF的表達在小腦持續(xù)存在，且最近有實驗證實HB-EGF在其它部位包括大腦皮質中也有表達。轉化生長因子-α在成熟腦內的神經(jīng)元和星形膠質細胞上均有表達。雙調蛋白也被證實在腦內有表達。而出生后EGF在腦內表達很少，并且β-細胞素和表皮調節(jié)素在CNS中沒有表達。 右旋美托咪啶在原代培養(yǎng)神經(jīng)元上不能引起ERK磷酸化，這種現(xiàn)象與其在皮層中間神經(jīng)元不增加胞質中游離Ca2+濃度([Ca2+]i)的現(xiàn)象相吻合。然而α2-腎上腺素能受體激