ADRB2信號(hào)通路調(diào)控肝癌發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:原發(fā)性肝癌(primary liver cancer)是世界上第五位最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其預(yù)后差、病死率極高。在2008年，大約有75萬(wàn)新發(fā)現(xiàn)的病例，并有近70萬(wàn)病例死于肝癌。而到了2012年，新發(fā)現(xiàn)的病例數(shù)已經(jīng)增加到了78萬(wàn)多人。肝細(xì)胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的組織類(lèi)型，占到全部肝癌的85％-90％。HCC起源于構(gòu)成肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的肝細(xì)胞，其發(fā)病情況在世界范圍內(nèi)分布很不均勻，超過(guò)80％的病例發(fā)生在非洲和東亞地區(qū)。而

2、在所有HCC病例中，有50％來(lái)自于中國(guó)。恰恰相反，南北美洲及歐洲的HCC發(fā)病率很低。有許多因素造成了HCC分布的不均一性，其中環(huán)境因素也是其中很重要的一個(gè)方面。
　　社會(huì)心理因素是一類(lèi)十分重要的環(huán)境因素，而應(yīng)激作為對(duì)機(jī)體生理病理影響最大的一類(lèi)社會(huì)心理因素，其對(duì)腫瘤的影響也日益受到人們的關(guān)注。近期有許多證據(jù)支持慢性應(yīng)激能夠影響腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展這一假說(shuō)。研究表明，交感神經(jīng)遞質(zhì)，如兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)或神經(jīng)肽類(lèi)，既能影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，又能引起腫

3、瘤血管的生成。因此，腎上腺素系統(tǒng)的激活對(duì)不同類(lèi)型腫瘤的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，并參與調(diào)解了應(yīng)激對(duì)腫瘤進(jìn)展的促進(jìn)作用。腎上腺素系統(tǒng)在應(yīng)激過(guò)程中釋放的兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)作為配體，是通過(guò)結(jié)合并激活細(xì)胞表面的腎上腺素能受體來(lái)發(fā)揮作用的。因此，研究應(yīng)激對(duì)腫瘤調(diào)控的本質(zhì)就是研究其激活的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面上的腎上腺素能受體對(duì)腫瘤細(xì)胞具有哪些調(diào)控作用。
　　本研究擬首先通過(guò)建立經(jīng)典的二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌模型，來(lái)觀察兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)能否在這個(gè)模型

4、中促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展。同時(shí)，要進(jìn)一步檢測(cè)肝癌組織和細(xì)胞中各類(lèi)腎上腺素能受體的表達(dá)水平，來(lái)確定哪種受體的激活能夠介導(dǎo)兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)的調(diào)控。接下來(lái)將重點(diǎn)研究該受體的激活通過(guò)怎樣的方式促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。這不僅能夠闡明應(yīng)激是否對(duì)肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響，更能為臨床控制肝細(xì)胞癌進(jìn)展及改善患者預(yù)后提供新的方法，相關(guān)的研究目前在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、建立小鼠二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)肝細(xì)胞

5、癌模型，通過(guò)給予小鼠腹腔注射腎上腺素或同時(shí)阻滯β2型腎上腺素能受體(ADRB2)來(lái)觀察對(duì)小鼠肝細(xì)胞癌發(fā)生情況及腫瘤生長(zhǎng)情況的影響;
　　2、使用ADRB2的特異性抑制劑ICI118，551，并通過(guò)CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例等實(shí)驗(yàn)方法，體外檢測(cè)阻滯ADRB2信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞系增殖及存活能力的影響;
　　3、使用電子透射電鏡觀察ICI118，551對(duì)細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)，并通過(guò)Western B

6、lot技術(shù)及GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法等檢測(cè)ICI118，551對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié);
　　4、構(gòu)建干擾ADRB2慢病毒所需的質(zhì)粒、包裝純化慢病毒。通過(guò)ADRB2干擾細(xì)胞系進(jìn)一步證實(shí)ADRB2信號(hào)通路對(duì)自噬的調(diào)控;
　　5、構(gòu)建體外誘導(dǎo)自噬的模型，并觀察ADRB2特異性激動(dòng)劑福莫特羅(FOR)對(duì)自噬的調(diào)節(jié);
　　6、利用Western Blot技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)(IP)等方法研究ADRB2信號(hào)通路對(duì)自噬調(diào)控的機(jī)制;

7、r>　　7、通過(guò)裸鼠皮下荷瘤模型檢測(cè)ADRB2信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖能力的影響及β受體阻滯劑抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果;
　　8、利用索拉菲尼進(jìn)行自噬誘導(dǎo)，通過(guò)Western Blot技術(shù)及GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法檢測(cè)ADRB2信號(hào)通路對(duì)索拉菲尼誘導(dǎo)的自噬的調(diào)節(jié)，并通過(guò)耐藥克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及裸鼠皮下荷瘤模型檢測(cè)ADRB2信號(hào)通路對(duì)索拉菲尼抗腫瘤效果的影響。
　　結(jié)果:
　　1、腎上腺素能夠促進(jìn)DEN誘

8、導(dǎo)的肝細(xì)胞癌的發(fā)生及進(jìn)展，并且這種促進(jìn)作用是通過(guò)激活A(yù)DRB2實(shí)現(xiàn)的;
　　2、阻滯ADRB2信號(hào)通路能夠在體外抑制肝癌細(xì)胞系的增殖和存活;
　　3、ADRB2信號(hào)通路對(duì)自噬具有負(fù)向調(diào)控的作用，并通過(guò)激活A(yù)kt及調(diào)節(jié)Beclin1參與的自噬復(fù)合物來(lái)發(fā)揮作用;
　　4、ADRB2信號(hào)通路激活后能夠抑制HIF1A的自噬性降解，從而促進(jìn)葡萄糖代謝;
　　5、裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)ADRB2信號(hào)通路激活能夠促進(jìn)皮下腫瘤的生

9、長(zhǎng)，β受體阻滯劑普萘洛爾能夠在一定程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng);
　　6、ADRB2信號(hào)通路能夠抑制索拉菲尼誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，并且阻滯ADRB2信號(hào)通路后能夠促進(jìn)索拉菲尼的抗腫瘤效果;
　　7、肝癌組織中ADRB2的表達(dá)聯(lián)合HIF1A的表達(dá)能夠很好地預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后。
　　結(jié)論:本研究從不同的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃腕w外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系這兩個(gè)方面，首次證明了在應(yīng)激條件下能夠被激活的ADRB2信號(hào)通路對(duì)肝癌發(fā)生及發(fā)展的影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，

10、一方面，ADRB2信號(hào)通路激活后能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤性和體外的增殖能力;另一方面，ADRB2信號(hào)通路的激活還能夠影響索拉菲尼的藥物敏感性，使機(jī)體對(duì)索拉菲尼更加耐受。而這些作用均是通過(guò)對(duì)細(xì)胞自噬的負(fù)向調(diào)控進(jìn)而增加HIF1A穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)的。研究首次報(bào)道了ADRB2信號(hào)通路與細(xì)胞自噬之間的關(guān)系，以及通過(guò)自噬對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。這為更好地理解應(yīng)激等外在環(huán)境因素對(duì)肝癌進(jìn)展的影響提供了線(xiàn)索和依據(jù)，同時(shí)也為臨床探索新的治療肝癌的方法指明了一個(gè)新