Wnt2B細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系和機(jī)制的研究.pdf

1、Wnt基因的名稱取自果蠅極性基因 Wingless和小鼠癌基因 Int-1。Wnt基因的胞外端信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在果蠅到人類的各種生物種普遍存在,并且是極少數(shù)在生物進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。Wnt家族由一系列分泌性的蛋白構(gòu)成,具有廣泛的生物功能,如細(xì)胞生成、生長(zhǎng)、分化及器官形成等?，F(xiàn)在一共發(fā)現(xiàn)有19中WNT基因,有一部分還擁有多種剪接變異體。根據(jù) Wnt蛋白在細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)作用的模式可以分為經(jīng)典和非經(jīng)典 Wnt蛋白兩類。
　　由

2、于 Wnt可以調(diào)控細(xì)胞的存活、增殖和運(yùn)動(dòng)而在胚胎發(fā)育領(lǐng)域備受關(guān)注。后來發(fā)現(xiàn) Wnt/catenin通路由于可以調(diào)控細(xì)胞增殖而與一系列疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展,如結(jié)腸癌、骨肉瘤、肝源性腫瘤,卵巢腫瘤、乳腺腫瘤和前列腺腫瘤。大量研究均提示 Wnt在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。
　　Wnt2B/Wnt13是第13個(gè)被克隆出的人 Wnt基因,后來發(fā)現(xiàn)此基因在小鼠、雞和斑馬魚上都高度保守。人類的Wnt2B與 W

3、nt2在基因序列有66.9％的相似,而小鼠則有71.1％的相似性。Wnt2B可以通過經(jīng)典 Wnt通路與 Frizzled受體相作用,也可以通過非經(jīng)典 Wnt通路作用于鈣離子通道。研究發(fā)現(xiàn) Wnt2B不僅在胚胎的腦,肺,腎,成人的心臟,腦,胎盤,肺,前列腺,卵巢,直腸等正常組織表達(dá),而且在多種人類腫瘤例如胃癌,基底細(xì)胞癌,乳腺癌,頭頸腫瘤,宮頸癌和白血病均有表達(dá)。Wnt2B在腫瘤的高表達(dá)提示此基因可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān),但是其中的機(jī)制并

4、不清楚。
　　本研究以卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、C13K和乳腺癌細(xì)胞系MCF7、MDA-MB-231為研究對(duì)象,探討Wnt2B信號(hào)通路在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥中的作用及可能機(jī)制和乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制,對(duì)闡明卵巢癌和乳腺癌惡性表型的發(fā)生機(jī)制和錨定以Wnt2B基因作為治療卵巢癌和乳腺癌的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分 Wnt2B對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥逆轉(zhuǎn)作用的研究
　　目的：
　　在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均存

5、在著Wnt2B的過表達(dá)現(xiàn)象。Wnt2B主要通過經(jīng)典WNT通路發(fā)生作用,然而Wnt2B在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制不甚清晰。本研究通過應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默Wnt2B的表達(dá),發(fā)現(xiàn)可以抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力和提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)中采用了SKOV3, OV2008, A2780和C13K四株卵巢癌細(xì)胞系,并且采用Western blotting方法檢測(cè)了Wnt2B的蛋白表達(dá)水平?？寺⌒纬赡?/p>

6、力和侵襲能力分別采用克隆形成實(shí)驗(yàn)和Matrigel膠transwell小室進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞存活率采用MTT檢測(cè),而細(xì)胞的凋亡率則采用細(xì)胞流式術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示在SKOV3, OV2008, A2780和C13K細(xì)胞中,A2780和C13K細(xì)胞Wnt2B的蛋白的表達(dá)水平明顯高于SKOV3和OV2008細(xì)胞( P<0.05);由于本實(shí)驗(yàn)采用siRNA基因沉默技術(shù)研究Wnt2B的分

7、子機(jī)制,因此采用A2780和C13K細(xì)胞系作為細(xì)胞的模型。
　　2、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,下調(diào)Wnt2B可以明顯抑制細(xì)胞的克隆形成能力和細(xì)胞的侵襲能力。MTT結(jié)果顯示,隨著泰素濃度呈梯度增加,沉默Wnt2B的A2780細(xì)胞的存活率明顯降低;同時(shí)順鉑濃度呈梯度增加,沉默Wnt2B的C13K細(xì)胞抑制率也呈現(xiàn)上升趨勢(shì),二者均存在良好的量效關(guān)系;流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率顯示,隨著泰素濃度的增加,隨著Wnt2B的表達(dá)下降

8、,A2780細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組;同時(shí),在順鉑作用下,沉默Wnt2B的C13K細(xì)胞凋亡率也明顯升高于( P<0.05),且隨著藥物濃度的升高,處理組細(xì)胞與未處理組的細(xì)胞凋亡率的差異越明顯。
　　3、 Western blot顯示沉默 Wnt2B后, caspase-9/BCL2/BCL-xL和epithelial–mesenchymal transition(EMT)/phosphorylated AKT(p-AKT)通路均受

9、到了明顯的抑制。
　　結(jié)論：
　　Wnt2B基因在卵巢癌耐藥細(xì)胞系中表達(dá)明顯高于其他卵巢癌細(xì)胞系,通過實(shí)驗(yàn)表明Wnt2B同時(shí)與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移和卵巢癌耐藥密切相關(guān),這可能提示W(wǎng)nt2B可能是一個(gè)卵巢治療的比較理想的靶點(diǎn)。
　　第二部分 Wnt2B對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用和機(jī)制的研究
　　目的：
　　通過體外實(shí)驗(yàn)探討Wnt2B在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　1、應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢

10、測(cè)正常乳腺組織和乳腺癌組織中Wnt2B的表達(dá);
　　2、采用RNA干擾技術(shù),在MCF7細(xì)胞中沉默Wnt2B的表達(dá),并經(jīng)Western blot檢測(cè)其沉默效率;
　　3、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)、觀察Wnt2B沉默后對(duì)MCF7細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架構(gòu)成的改變。同時(shí)在蛋白水平上檢測(cè)沉默Wnt2B后對(duì)細(xì)胞P53/P21通路的影響。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示,Wnt2B蛋白在乳腺癌中的表達(dá)率為88

11、％明顯高于正常乳腺組織10％。三對(duì)Wnt2B siRNA轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞后,Wnt2B均表達(dá)明顯下調(diào),以第二對(duì)siRNA(2號(hào)siRNA)沉默效果最為明顯,相對(duì)于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA其表達(dá)率為(13±5)％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2、采用2號(hào)siRNA轉(zhuǎn)染MCF748小時(shí)后細(xì)胞凋早期凋亡率和晚期凋亡率相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞均明顯增高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);
　　3、2號(hào)siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞早期凋亡

12、率為(4.99±0.78)％,晚期凋亡率為(29.39±2.11)％;對(duì)照細(xì)胞早期凋亡率為(1.21±0.11)％,晚期凋亡率為(2.82±0.45)％。
　　4、2號(hào)siRNA轉(zhuǎn)染MCF748小時(shí)后細(xì)胞骨架發(fā)生明顯改變,表現(xiàn)為細(xì)胞骨架溶解,正常形態(tài)消失。
　　5、2號(hào)siRNA轉(zhuǎn)染MCF748小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)P53及P21表達(dá)明顯下降,表達(dá)率分別為(11.57±0.17)％和(2.45±0.91)％,相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞中P53及P

13、21表達(dá)(表達(dá)率分別為(35.21±1.89)％和(15.97±3.65)％)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　Wnt2B基因可以改變?nèi)橄侔┘?xì)胞的凋亡水平和骨架結(jié)構(gòu),在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用,為乳腺癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。
　　第三部分 Wnt2B對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡作用和機(jī)制的的研究
　　目的:
　　腫瘤來源于自身的細(xì)胞,細(xì)胞的新生和死亡在正常情況下處于一個(gè)平衡狀態(tài),當(dāng)這個(gè)平衡狀

14、態(tài)被打破的時(shí)候即機(jī)體失去了對(duì)細(xì)胞的調(diào)控就產(chǎn)生了腫瘤。已有研究證實(shí)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中,Wnt2B扮演著非常重要的角色,但其中的分子機(jī)制尚不明確,尤其是有關(guān)細(xì)胞凋亡方面。在本研究中,應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)該基因與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可能是通過NF-κB途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡過程。
　　方法:
　　1、應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)正常乳腺組織和乳腺癌組織中Wnt2B的表達(dá);
　　2、應(yīng)用Western blot

15、檢測(cè)MCF7和MDA-MB-231的Wnt2B的表達(dá);
　　3、采用RNA干擾技術(shù),在MDA-MB-231細(xì)胞中沉默Wnt2B的表達(dá),并經(jīng)Western blot檢測(cè)其沉默效率;
　　4、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)、Wnt2B沉默后對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架構(gòu)成的改變;
　　5、采用凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)NF-κB/p65的激活情況;
　　結(jié)果:
　　1、我們應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了40例乳腺

16、癌組織標(biāo)本中Wnt2B的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)有35例乳腺癌組織的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性,同時(shí)我們?cè)陉?yáng)性組織中觀察到一個(gè)核漿轉(zhuǎn)移現(xiàn)象;
　　2、我們?cè)谌橄侔┡鋵?duì)細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF7中檢測(cè)Wnt2B的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-MB-231中Wnt2B表達(dá)明顯高于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MCF7。我們選擇在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt2B siRNA48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡明顯增加;
　　3、Wnt2B的表達(dá)下調(diào)同時(shí)還伴隨著NF-

17、κB/p65的表達(dá)下降和活性降低。
　　4、NF-κB/p65下游與凋亡密切相關(guān)的基因caspase3和caspase9表達(dá)也明顯的降低;
　　5、我們應(yīng)用NF-κB/p65特異性的抑制劑PDTC阻斷此通路后,發(fā)現(xiàn)Wnt2B siRNA不能再繼續(xù)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡以及caspase3和caspase9表達(dá)的改變。
　　結(jié)論:
　　Wnt2B通過 NF-κB/p65途徑調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的凋亡,這提示 Wnt2B可能通過調(diào)