mTOR信號(hào)通路調(diào)控豬瘟病毒復(fù)制的機(jī)制研究.pdf

1、豬瘟(Classical swine fever, CSF)是由豬瘟病毒（Classicalswine fever virus，CSFV）引起的一種以高熱、出血和免疫抑制為典型特征的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的必須報(bào)告的疫病，對(duì)我國(guó)乃至全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。CSFV屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬(Pestivirus)，是一種單股正鏈RNA病毒。目前對(duì)CSFV的致病機(jī)制雖有一

2、定的研究，但對(duì)于CSFV在宿主細(xì)胞中感染復(fù)制的機(jī)制，以及免疫逃逸的致病機(jī)理仍缺乏全面深入的了解。由于病毒要建立持續(xù)性感染，必須利用宿主細(xì)胞中可調(diào)控蛋白合成、能量代謝、細(xì)胞存活生長(zhǎng)的關(guān)鍵信號(hào)通路。因此，探討CSFV感染的宿主細(xì)胞中參與調(diào)控細(xì)胞存活、蛋白合成和細(xì)胞自噬等過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)通路，闡明其參與CSFV復(fù)制增殖的機(jī)制，為豬瘟的防治提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
　　哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapa

3、mycin，mTOR)信號(hào)通路連接著從感應(yīng)能量和生長(zhǎng)因子到調(diào)控細(xì)胞存活生長(zhǎng)及大分子合成代謝的過(guò)程，除了在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，也參與多種DNA、RNA病毒的感染復(fù)制，在病毒復(fù)制中扮演重要的角色。但對(duì)于CSFV與mTOR信號(hào)通路的關(guān)系，目前尚沒(méi)有明確報(bào)道。因此，本研究擬闡明CSFV對(duì)mTOR信號(hào)通路的調(diào)控，以及mTOR信號(hào)通路調(diào)控CSFV復(fù)制的分子機(jī)制，從mTOR的角度為解釋CSFV的復(fù)制和持續(xù)性感染提供新的理論依據(jù)。
　　

4、本研究首先利用細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路蛋白芯片技術(shù)以及western-blot等方法證實(shí)與未感染CSFV的細(xì)胞相比較，CSFV（石門(mén)強(qiáng)毒株）感染ST細(xì)胞能夠顯著抑制Akt/mTOR信號(hào)通路的激活，該抑制在6-24 h最為顯著，隨后逐漸恢復(fù)，至48h恢復(fù)至處理前水平。而CSFV結(jié)構(gòu)蛋白Erns、非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS5A在抑制Akt/mTOR信號(hào)通路的激活中發(fā)揮重要的作用。為了探討Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)CSFV自身復(fù)制的影響，利用mTOR抑制劑

5、rapamycin和激活劑insulin改變宿主細(xì)胞mTOR通路活性后感染CSFV，western-blot和熒光定量PCR等結(jié)果表明在24 h內(nèi)，rapamycin雖抑制細(xì)胞增殖但顯著促進(jìn)CSFV的復(fù)制;而insulin促進(jìn)細(xì)胞增殖但顯著抑制CSFV復(fù)制;值得注意的是在48 h時(shí)這一調(diào)控趨勢(shì)并不存在;我們推測(cè):CSFV感染抑制mTOR/S6K1，導(dǎo)致S6K1通過(guò)IRS（胰島素受體）誘導(dǎo)Akt負(fù)反饋激活，進(jìn)而抵消了由mTOR抑制引起的病

6、毒復(fù)制。隨后，我們進(jìn)一步探討mTOR上游Akt對(duì)CSFV復(fù)制的影響;分別應(yīng)用Akt特異性抑制劑(LY294002)抑制Akt活性，以及Akt激活劑(SC79)激活A(yù)kt后感染CSFV，熒光定量PCR結(jié)果表明，與未經(jīng)處理的ST細(xì)胞相比較，抑制Akt活性能夠在72 h內(nèi)持續(xù)上調(diào)CSFV基因組拷貝數(shù);而激活A(yù)kt則持續(xù)降低CSFV基因組拷貝數(shù)。與單獨(dú)改變mTOR活性引起的只在24 h內(nèi)調(diào)控病毒復(fù)制有所不同，這很有可能是由于CSFV感染引起mT

7、OR抑制誘導(dǎo)Akt負(fù)反饋激活以及Akt作為mTOR上游引起比mTOR更強(qiáng)的作用導(dǎo)致。上述研究結(jié)果表明Akt/mTOR信號(hào)通路可負(fù)調(diào)控CSFV的復(fù)制，也提示CSFV感染ST細(xì)胞可能通過(guò)誘導(dǎo)Akt負(fù)反饋激活來(lái)調(diào)控病毒復(fù)制和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。
　　為了深入探究Akt/mTOR信號(hào)通路負(fù)調(diào)控CSFV復(fù)制的分子機(jī)制，本研究以mTOR信號(hào)通路下游調(diào)控自噬及蛋白合成的兩個(gè)效應(yīng)分子ULK1和S6K1為切入點(diǎn)，應(yīng)用透射電鏡、western-blot、共

8、聚焦顯微鏡、LC3雙熒光自噬慢病毒、IFA檢測(cè)病毒滴度以及熒光定量PCR等方法證明CSFV感染能夠增強(qiáng)ST細(xì)胞的自噬流，隨后應(yīng)用rapamycin和insulin以及ULK1抑制劑抑制或激活mTOR/ULK1活性，結(jié)果顯示自噬被顯著促進(jìn)或抑制，而病毒的復(fù)制被相應(yīng)的促進(jìn)或抑制。證明CSFV通過(guò)mTOR/ULK1依賴(lài)的信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制。另一方面，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，通過(guò)構(gòu)建含CSFV內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)

9、的螢火蟲(chóng)熒光素酶重組載體(CSFV-IRES)，應(yīng)用過(guò)表達(dá)和shRNA干擾等方法證明過(guò)表達(dá)和干擾表達(dá)S6K1能夠抑制和促進(jìn)CSFV-IRES蛋白驅(qū)動(dòng)活性，隨后病毒滴度檢測(cè)和熒光定量PCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)和干擾表達(dá)S6K1能抑制和促進(jìn)CSFV復(fù)制。接著，利用免疫共沉淀、核糖體分離技術(shù)以及熒光定量PCR等方法證實(shí)，CSFV感染ST細(xì)胞能抑制mTOR/S6K1磷酸化激活，進(jìn)而促進(jìn)S6K1與真核起始因子3(eIF3A)的結(jié)合，釋放CSFV-IR

10、ES與eIF3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合40S核糖體，促進(jìn)病毒mRNA翻譯。
　　Akt/mTOR信號(hào)通路抑制能夠?qū)е录?xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡，而在體外，CSFV感染宿主細(xì)胞通常不抑制細(xì)胞增殖和凋亡。因此結(jié)合以上的研究，我們探討CSFV感染抑制Akt/mTOR信號(hào)通路是否通過(guò)誘導(dǎo)Akt負(fù)反饋維持細(xì)胞增殖和抗凋亡，以便于為病毒復(fù)制提供穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。通過(guò)western-blot檢測(cè)CSFV感染后Akt磷酸化水平，結(jié)果表明Akt磷酸化水平先降低后恢復(fù)，

11、進(jìn)一步證實(shí)CSFV感染ST細(xì)胞可誘導(dǎo)Akt負(fù)反饋激活。隨后流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CSFV感染初期能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯于G0/G1期，而48 h后沒(méi)有阻滯作用;另外使用Akt抑制劑LY294002單獨(dú)或與CSFV共同作用ST細(xì)胞，SRB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示抑制Akt活性同時(shí)感染CSFV較單獨(dú)抑制Akt或單獨(dú)感染CSFV時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制顯著增強(qiáng)，間接提示CSFV感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞Akt負(fù)反饋激活，維持宿主細(xì)胞增殖，而一旦Akt被抑制劑持續(xù)抑

12、制，感染CSFV誘導(dǎo)的Akt負(fù)反饋激活也被相應(yīng)地抑制，因此不能維持細(xì)胞增殖。接著，細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，抑制Akt活性同時(shí)感染CSFV較單獨(dú)抑制Akt或單獨(dú)感染CSFV時(shí)對(duì)細(xì)胞引起的凋亡率更大，證明CSFV誘導(dǎo)的負(fù)反饋激活能夠維持細(xì)胞存活。最后，以Akt抑制劑與CSFV共同作用ST細(xì)胞至24 h、48h、72 h，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與單獨(dú)感染CSFV細(xì)胞相比較，在72 h內(nèi)持續(xù)阻斷Akt能夠持續(xù)上調(diào)病毒基因組拷貝數(shù)，進(jìn)一步提示