紫花苜蓿高頻再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、本文利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將木霉幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿秘魯中，提高其抗菌性。 本文探討了三種品種紫花苜蓿(隴東苜蓿、阿爾岡金、秘魯)的組織培養(yǎng)程序，確定出再生能力最強(qiáng)的品種及外植體。通過(guò)植物表達(dá)載體(PBI121+CHI)的構(gòu)建，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化木霉幾丁質(zhì)酶(CHI)基因，建立了一套農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜?；蜣D(zhuǎn)化的優(yōu)化體系。 主要研究結(jié)果如下：1、組織培養(yǎng)再生能力的建立試驗(yàn)表明：MS+2,4-D(2.0mg/L)+6-BA(0

2、.5mg/L)+蔗糖0.3﹪+瓊脂0.08﹪；MS+KT(0.5mg/L)+NAA(0.01mg/L)+蔗糖0.3﹪+瓊脂0.08﹪；1/2MS+NAA(0.01mg/L+蔗糖0.15﹪+瓊脂0.08﹪分別是紫花苜蓿的愈傷組織、芽、根的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基。下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)高于子葉節(jié)，并且不同品種間秘魯遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于阿爾岡金和隴東苜蓿，通過(guò)三個(gè)不同品種的六組重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在A3培養(yǎng)基上下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率比子葉節(jié)的高，但分化效果卻相對(duì)

3、低。由此可見(jiàn)，不同激素濃度配比的培養(yǎng)基再生體系的建立影響不同。在4種分化培養(yǎng)基中B1培養(yǎng)基植株再生分化頻率最高可達(dá)96﹪，B4分化頻率最低，下胚軸：B4＜B1＜B2＜B3(52﹪＜58﹪＜64﹪＜74﹪)；子葉節(jié)：B4＜B3＜B2＜B1(56﹪＜60﹪＜82﹪＜96﹪)。在相同生長(zhǎng)素濃度、不同細(xì)胞分裂素濃度的分化培養(yǎng)基中，B1培養(yǎng)基分化頻率相對(duì)高于其它培養(yǎng)基，即：B1＞B2＞B3＞B4。試驗(yàn)結(jié)果表明，愈傷組織分化頻率不是由激素配比值決定

4、的，而是由不同濃度激素之間協(xié)同作用的結(jié)果。本試驗(yàn)中B1為最佳分化培養(yǎng)基，紫花苜蓿秘魯子葉節(jié)分化頻率最高。 2、植物表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因(CHI，序列長(zhǎng)度1275bp左右)克隆到植物雙元表達(dá)載體PBI121(14758bp)上，即：CHI基因取代GUS基因插入到質(zhì)粒PBI121上，構(gòu)建成表達(dá)載體PBI121+CHI，通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中，得到植物表達(dá)載體。 3、CHI基因轉(zhuǎn)化體系的建立以農(nóng)桿菌為載體，對(duì)紫花苜蓿