1、本文利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將木霉幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿秘魯中,提高其抗菌性。 本文探討了三種品種紫花苜蓿(隴東苜蓿、阿爾岡金、秘魯)的組織培養(yǎng)程序,確定出再生能力最強的品種及外植體。通過植物表達載體(PBI121+CHI)的構(gòu)建,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化木霉幾丁質(zhì)酶(CHI)基因,建立了一套農(nóng)桿菌介導(dǎo)苜?;蜣D(zhuǎn)化的優(yōu)化體系。 主要研究結(jié)果如下:1、組織培養(yǎng)再生能力的建立試驗表明:MS+2,4-D(2.0mg/L)+6-BA(0
2、.5mg/L)+蔗糖0.3﹪+瓊脂0.08﹪;MS+KT(0.5mg/L)+NAA(0.01mg/L)+蔗糖0.3﹪+瓊脂0.08﹪;1/2MS+NAA(0.01mg/L+蔗糖0.15﹪+瓊脂0.08﹪分別是紫花苜蓿的愈傷組織、芽、根的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基。下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率相對高于子葉節(jié),并且不同品種間秘魯遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于阿爾岡金和隴東苜蓿,通過三個不同品種的六組重復(fù)試驗數(shù)據(jù)表明,在A3培養(yǎng)基上下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率比子葉節(jié)的高,但分化效果卻相對
3、低。由此可見,不同激素濃度配比的培養(yǎng)基再生體系的建立影響不同。在4種分化培養(yǎng)基中B1培養(yǎng)基植株再生分化頻率最高可達96﹪,B4分化頻率最低,下胚軸:B4<B1<B2<B3(52﹪<58﹪<64﹪<74﹪);子葉節(jié):B4<B3<B2<B1(56﹪<60﹪<82﹪<96﹪)。在相同生長素濃度、不同細(xì)胞分裂素濃度的分化培養(yǎng)基中,B1培養(yǎng)基分化頻率相對高于其它培養(yǎng)基,即:B1>B2>B3>B4。試驗結(jié)果表明,愈傷組織分化頻率不是由激素配比值決定
4、的,而是由不同濃度激素之間協(xié)同作用的結(jié)果。本試驗中B1為最佳分化培養(yǎng)基,紫花苜蓿秘魯子葉節(jié)分化頻率最高。 2、植物表達載體的構(gòu)建將目的基因(CHI,序列長度1275bp左右)克隆到植物雙元表達載體PBI121(14758bp)上,即:CHI基因取代GUS基因插入到質(zhì)粒PBI121上,構(gòu)建成表達載體PBI121+CHI,通過凍融法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中,得到植物表達載體。 3、CHI基因轉(zhuǎn)化體系的建立以農(nóng)桿菌為載體,對紫花苜蓿