農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿BADH基因高效轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化和轉(zhuǎn)基因植株的檢測.pdf

1、土壤鹽漬化是一個世界性問題,是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的一個非常重要的非生物脅迫因素.如何利用大面積的鹽堿地,提高作物耐鹽性是生物科學(xué)的一個重要研究課題.苜蓿是一種被譽(yù)為"牧草之王"的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草,它不僅營養(yǎng)價值高,適口性好,適應(yīng)性強(qiáng)、抗寒耐旱,是全世界廣為種植的優(yōu)良牧草,而且對生態(tài)環(huán)境治理、固土護(hù)坡、防止水土流失起到非常重要的作用.如何進(jìn)一步提高其耐鹽抗旱特性,擴(kuò)大其種植范圍,是當(dāng)前苜蓿生產(chǎn)面臨的重要研究課題,基因工程的發(fā)展和應(yīng)用

2、為苜?？果}育種開辟了一條新的途徑.本實驗是苜?？果}堿育種研究課題的一部分,是在已建立的苜蓿高頻組培再生體系的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜菜堿醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步研究.主要結(jié)果如下:1.優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜蓿高效遺傳轉(zhuǎn)化體系.本試驗在已有工作的基礎(chǔ)上,對轉(zhuǎn)化體系各因子進(jìn)行了優(yōu)化,確定了Cef最適濃度為400mg/L,Kan最適濃度為50mg/L;以GUS陽性發(fā)生率和抗性愈傷組織率為轉(zhuǎn)化指標(biāo)探討了不同苜?；蛐汀⒉煌庵搀w類型和外植體的

3、不同生理狀態(tài)對轉(zhuǎn)化效率的影響,并選取轉(zhuǎn)化效率高的基因型作為主要受體,侵染15天左右的葉片;在其它因子條件的優(yōu)化中,適宜的菌液濃度OD<,600>值為0.3-0.5,侵染時間15-20分鐘,無預(yù)培養(yǎng),共培養(yǎng)3-4天,在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基及共培養(yǎng)基中都加入乙酰丁香酮(10mg/L)的處理方式比較好,侵染效率比較高.2.轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測.轉(zhuǎn)化研究中獲得了大量Kan抗性愈傷組織,愈傷組織分化出再生植株后,提取其DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),以PC

4、R-Southern確定擴(kuò)增出來的條帶為特異性條帶,在145個檢測株系中,共獲得34個呈陽性反應(yīng)的株系.結(jié)果表明BADH基因已成功的轉(zhuǎn)入苜?；蚪M中.3.轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性試驗.組培條件下的抗鹽梯度實驗表明:未轉(zhuǎn)基因植株在鹽濃度達(dá)到0.7﹪時就停止生長,超過0.9﹪植株大部分已白化死亡,而轉(zhuǎn)基因植株在鹽濃度0.7-0.9﹪時基本能正常生長,在1.2﹪鹽害脅迫時出現(xiàn)明顯受害癥狀,表現(xiàn)為植株停止生長和葉片白化.由此說明BADH基因在轉(zhuǎn)化植株