丹參酮ⅡA對動脈粥樣硬化的影響及其可能分子機制研究.pdf

1、為了進一步研究其可能的生物學作用和作用機制，分別用體內(nèi)試驗(采用ApoE-/-小鼠模型)和體外試驗(采用巨噬泡沫細胞模型)，研究其可能的分子機制并進一步明確丹參酮Ⅱ A抗As可能的作用靶點。 研究方法： 一．丹參酮ⅡA對動脈粥樣硬化的影響 1.動物的分組和處理 采用經(jīng)典的ApoE-/-。小鼠模型，將其隨機分為七組，分別為正常組(C57BL/6J)，模型組(ApoE-/-)，模型+丹參酮ⅡA高劑量組(Ap

2、oE-/-+TS(90mg/kg))，模型+丹參酮Ⅱ A中劑量組(ApoE-/-+TS(30 mg/kg))，模型+丹參酮Ⅱ A低劑量組(ApoE-/-+TS(10 mg/kg))，模型+辛伐他丁(ApoE-/-+Sim(10mg/kg))，模型+維生素E(ApoE-/-+VE(100 mg/kg))，藥物用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)作溶劑，所有組別皆給予正常飼料。動態(tài)檢測血脂水平并動態(tài)觀察動脈粥樣硬化斑塊形成程度，直至26周。

3、 2.丹參酮Ⅱ A對動脈粥樣硬化形成的影響 ①丹參酮Ⅱ A對動脈粥樣硬化斑塊面積的影響 將小鼠的主動脈分離取出，然后取其主動脈弓，縱向剖開作油紅O染色，做成病理切片后用熒光顯微鏡(sony-DXC960MD)觀察拍照，運用IPWIN60進行分析。 ②丹參酮ⅡA對血清中血脂水平和肝臟中血脂水平的影響 血清中總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的檢測使用常規(guī)的酶法試劑盒(北京中生北控)。肝臟中TC和TG的檢

4、測采用100mg/ml在蒸餾水中勻漿，后采用氯仿甲醇(2/1，v/v)萃取，提取的脂質(zhì)用液氮吹干后用異丙醇重新溶解，通過試劑盒檢測起血脂的濃度。 ③丹參酮ⅡA對血清中oxLDL的影響 采用ELISA法檢測血清中的oxLDL的含量。嚴格按照試劑盒所附說明書進行操作。在包被好抗兔oxLDL，抗體的96孔板中加入50ul的標準，蒸餾水，和樣本，然后加入生物素結(jié)合的反應(yīng)液50ul，將其置于37℃孵育60min。孵育結(jié)束后，將反應(yīng)

5、液倒出，然后用在洗板機上用專用的洗滌液洗5次，將未結(jié)合的從孔內(nèi)洗去，然后將50u1的酶結(jié)合反應(yīng)液加入孔內(nèi)將其置于37℃孵育30min，再一次在洗板機上用洗滌液洗5次，然后分別加入50ul的顯色劑A和顯色劑B置于37℃孵育15min，最后加入終止液終止反應(yīng)，置于酶標儀上在450nm處檢測吸光度值(OD)。同時依據(jù)一個劑量依賴的標準曲線可以最終得出樣品血清中oxLDL的濃度。 ④丹參酮ⅡA對血清中SOD和MDA的影響 分別采

6、用常規(guī)的試劑盒檢測血清中SOD活性和MDA含量。各組血清的SOD活性和MDA含量檢測的具體方法嚴格按照試劑盒所附說明書進行。在檢測之前摸索一個最佳的反應(yīng)體積，經(jīng)摸索血清SOD的最佳上樣量為2ul。 ⑤丹參酮Ⅱ A對膽固醇攝取相關(guān)基因(CD36,SR-A)表達的影響 提取小鼠胸腹主動脈中的RNA,采用半定量RT-PCR的方法檢測膽固醇攝取相關(guān)基因表達的情況。 ⑥丹參酮Ⅱ A對PPAR-γ表達的影響 提取小鼠

7、胸腹主動脈中的RNA,采用半定量的RT-PCR的方法檢測PPAR-γ表達的情況。 二．丹參酮ⅡA對巨噬細胞攝取膽固醇的影響 1.巨噬細胞的培養(yǎng)與巨噬泡沫細胞模型的建立 2.丹參酮Ⅱ A對巨噬細胞膽固醇攝取的影響 3.丹參酮ⅡA對巨噬細胞膽固醇攝取相關(guān)基因以及對PPAR~表達的影響。 研究結(jié)果： 一．丹參酮ⅡA對動脈粥樣硬化的影響 1.與正常對照組相比，26W后各組ApoE-/-小鼠

8、在體重和一般特征上沒有顯著性差異 2.與正常對照組相比，26W后模型組ApoE-/-鼠斑塊面積有明顯的顯著性差異，而與模型組ApoE-/-小鼠相比，丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠斑塊面積具有明顯的改善作用，且隨著劑量的增加具有明顯的劑量依賴性，同時使用的兩個陽性對照藥亦具有很好的改善斑塊形成的作用。 3.與正常對照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠胸腹主動脈血脂水平明顯升高，與正常對照組相比有顯著性差異，而與模型組

9、ApoE-/-小鼠相比，丹參酮ⅡA應(yīng)用組ApoE-/-小鼠胸腹主動脈血脂具有明顯的下降，且具有劑量依賴性。同時使用的兩個陽性對照藥亦具有很好的降低胸腹主動脈血脂的作用，且丹參酮Ⅱ A高劑量組的作用與其作用基本相似。 4.與正常對照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠血清中TC和TG水平明顯升高，但應(yīng)用丹參酮Ⅱ A對血清中血脂沒有影響，VE組亦沒有影響，辛伐他丁組卻能很好的顯示其降血脂的作用 5.與正常對照組相比，26

10、W后模型組．ApoE-/-小鼠肝臟中TC和TG水平明顯升高，但應(yīng)用丹參酮ⅡA組對肝臟中血脂沒有影響，VE組亦沒有影響，辛伐他丁組卻能很好的顯示其降血脂的作用 6.與正常對照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠血清中oxlLDL含量明顯升高，而與模型組ApoE-/-小鼠相比，丹參酮Ⅱ A應(yīng)用組ApoE-/-小鼠血清oxLDL水平具有明顯的下降，且具有明顯的劑量依賴性，陽性對照藥物辛伐他丁和VE組亦具有降低血清中oxLDL的作用

11、 7.與正常對照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠血清中SOD水平明顯下降，而與模型組ApoE-/-小鼠相比，丹參酮IIA應(yīng)用組ApoE-/-小鼠血清中SOD明顯升高，且具有劑量依賴性，陽性對照藥物辛伐他丁和VE組亦有升高血清中SOD的作用。與正常對照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠血清中MDA水平明顯升高，而與模型組ApoE-/-小鼠相比，丹參酮IIA應(yīng)用組ApoE-/-小鼠血清中MDA水平明顯下降，且具有劑量依

12、賴性，同時陽性對照藥物辛伐他丁和VE組亦有降低血清中MDA的作用． 8.與正常對照組相比，26W后模型組ApoE-/-小鼠胸腹主動脈膽固醇攝取相關(guān)基因CD36和SR-A具有顯著的上調(diào)，而與模型組ApoE-/-小鼠相比，丹參酮ⅡA應(yīng)用組對膽固醇攝取相關(guān)基因具有劑量依賴性的顯著從下調(diào)作用，而陽性對照藥物辛伐他丁和VE組雖亦有下調(diào)作用，但其作用相對丹參酮Ⅱ A而言比較的微弱。 二．丹參酮ⅡA對巨噬細胞膽固醇攝取的影響

13、1.丹參酮ⅡA抑制巨噬細胞對膽固醇的攝取 與正常對照組相比，將O．1 μ M，1 μ M，10 μ M丹參酮Ⅱ A分別與巨噬細胞預孵育24h,用MTT。法來評價丹參酮Ⅱ A對巨噬細胞的毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.1 μM．1 μ M．10 μ M丹參酮Ⅱ A作用細胞后，吸光度值沒有明顯變化，說明實驗所用的丹參酮ⅡA濃度對巨噬細胞的毒性和增殖沒有明顯的影響。 與正常對照組相比，將0.1 μ M，1 μ M，10 μ M丹參酮ⅡA分

14、別與巨噬細胞預孵育2h，再與50 μ g/ml的oxLDL作用24h，酶法檢測細胞總膽固醇和游離膽固醇的含量，對細胞總膽固醇和游離膽固醇的含量檢測發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅱ A能夠很好的抑制巨噬細胞對膽固醇的攝取，且具有劑量依賴性，其最大的抑制率可以達到40％左右。 與正常對照組相比，將0.1 μ M，1 μ M，10 μ M丹參酮Ⅱ A分別與巨噬細胞預孵育2h，再與DiI標記的oxLDL作用4h,熒光顯微鏡下定性觀察丹參酮Ⅱ A對巨噬細胞

15、膽固醇攝取的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅱ A能夠很好的抑制巨噬細胞對膽固醇的攝取，且具有劑量依賴性。 2.丹參酮Ⅱ A對巨噬細胞膽固醇攝取相關(guān)基因以及基因PPAR-γ表達的影響 與正常對照組相比，模型組(oxLDL)膽固醇攝取相關(guān)基因CD36和SR-A以及PPAR-γ顯著上調(diào)，而丹參酮Ⅱ A組能夠顯著下調(diào)CD36和PPAR-γ的表達，但對SR-A的表達卻無明顯的影響。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA組能夠在蛋白水平上顯著的下調(diào)C

16、D36的表達。 小結(jié)： 1.丹參酮Ⅱ A能夠顯著改善動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展，這一作用具有明顯的劑量．效應(yīng)關(guān)系 2.丹參酮Ⅱ A改善動脈粥樣硬化的形成不是通過影響血脂的水平，可能是通過以下機制共同作用實現(xiàn)：通過抗氧化作用降低血清中oxLDL的水平，改善血清中SOD和MDA的水平；抑制主動脈中膽固醇攝取相關(guān)基因CD36和SR-A而抑制泡沫細胞的形成，而對CD36的下調(diào)可能是通過下調(diào)PPAR-γ實現(xiàn)。 3.丹