促甲狀腺激素對促動脈粥樣硬化因子的影響及其機制研究.pdf

1、目的:亞臨床甲減(SCH)被定義為血清TSH水平高于正常范圍并且血清甲狀腺激素(游離T3(FT3)以及游離T4(FT4))水平在正常范圍內(nèi)，在近年來受到了越來越多的關注。在成年人中亞臨床甲減的患病率為4％-20％。許多流行病學研究已經(jīng)證明了亞臨床甲減是動脈粥樣硬化的重要危險因素，并且與頸動脈內(nèi)膜中層厚度(IMT)的增加以及血脂異常相關。骨橋蛋白(OPN)是一種最初在骨中被發(fā)現(xiàn)的磷酸化糖蛋白，近年來有研究證明其在動脈粥樣硬化的病理發(fā)生過程

2、中發(fā)揮了重要作用。大量研究報道OPN在人動脈粥樣硬化斑塊中表達增多并且與冠狀動脈疾病的嚴重程度相關。整合蛋白αvβ3(Integrinαvβ3)是一種粘附分子受體，已有研究表明相比于正常血管，無論是非動脈粥樣硬化性的內(nèi)皮浸潤性增厚還是動脈粥樣硬化斑塊組織，其中Integrinαvβ3的表達水平均增加，可見Integrinαvβ3在動脈粥樣硬化病理過程中也起到了關鍵作用。血管細胞間粘附分子(V CAM-1)是一種經(jīng)典的粘附分子，可以介導單

3、核細胞和血管壁的相互作用，在內(nèi)皮的炎性反應過程中扮演了重要角色。有研究表明人主動脈內(nèi)皮細胞(HACE)以及人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中存在TSH受體(TSHR)的表達。在臨床研究中，關于TSH對血管內(nèi)皮功能的影響尚存在一定爭議。有的研究發(fā)現(xiàn)快速注射人重組促甲狀腺激素(rhTSH)可以引起快速的內(nèi)皮介導的血管舒張，而另外一些研究卻得到了與此相反的結論。關于TSH與不同血管內(nèi)皮細胞的基礎研究目前較少，相關結果尚無定論。有學者發(fā)現(xiàn)TSH作

4、用于人主動脈內(nèi)皮細胞，可以介導環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和一氧化氮(NO)的表達增加，同時降低血管收縮因子內(nèi)皮素的表達，上述結果證明TSH對內(nèi)皮功能有保護作用。但是，另外一些實驗證明了TSH可以引起內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和前列腺素I2(PGI2)表達的降低以及內(nèi)皮素和血漿纖溶酶原激活物抑制劑（PAI-1）表達的增加，這證明了TSH對內(nèi)皮細胞存在破壞作用。目前關于TSH對促動脈粥樣硬化因子，如OPN、Integrinαvβ3以及VCA

5、M-1的直接影響尚沒有證據(jù)。本研究探討人群中TSH與動脈粥樣硬化危險因素的關系，探究亞臨床甲減對大鼠主動脈中OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1的影響，以及TSH對HUVEC上述因子的作用機制。
　　方法:1.本研究的對象來自于2014年中國醫(yī)科大學內(nèi)分泌研究所在沈陽市南站社區(qū)進行的流行病學調(diào)查。共有533人在2014年參與了調(diào)查，2015年對該人群中的440人進行了隨訪，并簽署知情同意書，隨訪率為82.55％。最終共

6、有322人納入調(diào)查，年齡為40-69歲。按照2014年甲狀腺功能測定結果，診斷亞臨床甲減患者36人，甲狀腺功能正常者286人。排除標準為:未參加頸動脈超聲檢查;既往有甲狀腺疾病史;應用影響甲狀腺功能的藥物，如甲狀腺激素或抗甲狀腺藥物等;經(jīng)2014年甲狀腺功能測定診斷為臨床甲減和臨床甲亢者;有腫瘤史、慢性腎病史、心梗史、腦梗死病史;重要信息缺失者。采集空腹靜脈非抗凝血分別檢測TSH、FT4、FT3、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、

7、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，頸動脈超聲檢測IMT。
　　2.30只雄性Wistar大鼠重約180-200g購自北京維通利華公司，正常喂養(yǎng)。將大鼠隨機分為三組:亞臨床甲減組(SCH，n=10)，臨床甲減組(CH，n=10)以及正常對照組(CON，n=10)。CH以及SCH組大鼠進行甲狀腺全切除術，建立臨床甲減模型。CON組大鼠給予甲狀腺切除的假手術但不切除甲狀腺。術后四周，SCH組大鼠給予皮下

8、注射L-T4每日0.95μg/100g，CH組以及CON組大鼠給予同等量的生理鹽水。術后大鼠均在飲水中給予0.1％(w/v)葡萄糖酸鈣并喂養(yǎng)正常飲食。所有血樣均立即13000轉(zhuǎn)離心10分鐘，長期儲存在-80℃。免疫化學發(fā)光法檢測大鼠血清TT4和TSH水平。分離大鼠主動脈組織，分成幾部分分別保存在-80℃或用于其他實驗。Western Blot法檢測大鼠主動脈組織OPN、VCAM-1以及Integrinαvβ3蛋白的水平。免疫組化法檢測大

9、鼠主動脈內(nèi)皮OPN、VCAM-1以及Integrinαvβ3的水平并用ImagePro Plus軟件進行分析。大鼠主動脈組織用2.5％戊二醛4℃固定，透射電鏡掃描進行超微結構觀察。所有結果均有SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學差異。
　　3.HUVEC在無血清的ECM培養(yǎng)基中饑餓12小時后給予TSH刺激。給予HUVEC不同濃度TSH(0，0.1，1，10，100mIU/ml)24小時，或給予10 mIU

10、/ml TSH不同作用時間(0，2，6，12，24，48h)。Erk特異性抑制劑PD98059以及Akt特異性抑制劑LY294002給予HUVEC1小時后進行TSH刺激。提取細胞全蛋白以及mRNA，Western Blot法檢測HUVEC中OPN、VCAM-1以及Integrinαvβ3蛋白的水平，Real-Time PCR法檢測HUVEC中OPN、 VCAM-1以及Integrinαvβ3 mRNA的表達。運用透射電鏡觀察HUVEC的

11、超微結構改變。
　　結果:1.應用偏相關分析以及二元Logistic回歸，分析2014年TSH與頸動脈內(nèi)膜增厚的關系。校正年齡、吸煙、收縮壓、舒張壓、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、血脂水平以及FT3、FT4后，TSH與頸動脈內(nèi)膜增厚呈正相關（B=0.196，P=0.031），具有統(tǒng)計學差異。2.應用偏相關分析以及多元線性回歸分析2014年TSH與IMT的相關性。結果發(fā)現(xiàn)年齡（B=0.005，P=0.000）、收縮壓水平（B=0.001，P=

12、0.016）、BMI（B=0.005，P=0.007）和IMT呈現(xiàn)正相關，具有顯著統(tǒng)計學差異。按照年齡將人群分為三組，40-49歲，50-59歲，60-69歲，分別校正吸煙、性別、血壓水平、血脂水平、BMI水平，在60-69年齡組，TSH是IMT的危險因素(B=0.015，P=0.020)，結果表明，TSH每升高1mIU/L，IMT值平均增厚0.015mm。3.給予L-T4注射四周后眶后靜脈采血，SCH組大鼠TT4升高接近正常水平，TS

13、H仍顯著高于CON組(P＜0.05），符合亞臨床甲減改變;CH組TSH仍然顯著升高，TT4低于CON組（P＜0.05），符合甲減改變。4.亞臨床甲減能夠上調(diào)大鼠主動脈組織中OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1蛋白的水平（P＜0.05），雖然甲減組OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1的蛋白水平較亞臨床甲減組高，但是不具有統(tǒng)計學差異。5.透射電鏡下，CON組大鼠的主動脈內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)了完整的細胞膜和清晰的核膜，內(nèi)皮細胞

14、間連接緊密。SCH組大鼠主動脈內(nèi)皮細胞膜部分破壞和溶解，部分細胞核形異常，線粒體外膜模糊、嵴減少。CH組部分內(nèi)皮細胞脫落，彈力板裸露，一些細胞核型不規(guī)則并且呈現(xiàn)染色質(zhì)邊集，細胞膜溶解或一定程度的破壞。細胞質(zhì)中，一些細胞的線粒體空泡樣變，外膜破壞。6.在0到10mIU/ml濃度之間，HUVEC中OPN以及Integrinαvβ3的蛋白水平和mRNA表達呈現(xiàn)劑量依賴的形式。TSH濃度為10mIU/ml時，OPN和Integrinαvβ3的表

15、達量與對照組相比有顯著的統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。7.在0到10mIU/ml濃度之間，HUVEC中VCAM-1的蛋白水平和mRNA表達呈現(xiàn)劑量依賴的形式。TSH濃度為1mIU/ml、10mIU/ml時，VCAM-1的表達量與對照組相比有顯著的統(tǒng)計學差異（P＜0.05)。8.隨著TSH作用時間延長，VCAM-1的蛋白水平和mRNA表達升高，在0到24h之間，呈現(xiàn)時間依賴方式增長，在6h、12h和24h后VCAM-1的mRNA表達量分別是

16、對照組的1.49，1.67和2.02倍（P＜0.05）。9.隨著TSH作用時間延長，OPN的蛋白水平和mRNA表達升高，在6h、24h和48h后OPN的mRNA表達量分別是對照組的1.92，2.55和2.24倍（P＜0.05）。10.隨著TSH作用時間延長，Integrinαvβ3的蛋白水平和mRNA表達升高，在TSH作用24h后最顯著（P＜0.01）。與OPN的升高趨勢相一致，Integrinαvβ3的mRNA表達量在TSH作用6h，

17、24h和48h后是正常對照組的2.08，2.35，和1.76倍。11.透射電鏡下發(fā)現(xiàn)，隨著TSH濃度以及作用時間延長，HUVEC的超微結構改變逐漸加重。12.10 mIU/ml TSH作用于HUVEC不僅可以提高OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1的蛋白水平，也可以增加p-Akt的表達。進一步使用Akt通路抑制劑LY294002，結果顯示LY294002可以顯著抑制TSH引起的OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1

18、表達水平升高（P＜0.05）。13.10 mIU/ml TSH作用于HUVEC不僅可以提高OPN，Integrinαvβ3以及VCAM-1的表達水平，也可以增加p-Erk的表達。使用Erk通路抑制劑PD98059，結果顯示PD98059不能夠抑制TSH引起的OPN、Integrinαvβ3以及VCAM-1蛋白水平升高。
　　結論:1.TSH與頸動脈內(nèi)膜增厚呈顯著正相關，在年齡為60-69歲的人群中，TSH是IMT增加的獨立危險因素