BMSCs對(duì)糖尿病創(chuàng)面PMNs和MΦ浸潤(rùn)及其趨化因子表達(dá)影響的研究.pdf

1、研究背景
　　我國(guó)目前是世界上糖尿病患病人數(shù)最多的國(guó)家,到2011年達(dá)9千萬(wàn)人。糖尿病創(chuàng)面愈合治療成為亟待研究解決的問(wèn)題。創(chuàng)面愈合是多細(xì)胞多分子相互協(xié)調(diào)作用的結(jié)果。早期創(chuàng)面炎癥細(xì)胞扮演著啟動(dòng)創(chuàng)面愈合的作用。研究顯示糖尿病患者機(jī)體“亞臨床炎癥”狀態(tài)可能抑制糖尿病創(chuàng)面早期炎癥反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖尿病創(chuàng)面形成早期炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不足及延遲,可能是糖尿病創(chuàng)面遷延愈合或不愈合的原因之一。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)促進(jìn)中性細(xì)胞(PMNs)和巨噬細(xì)胞(MΦ)早

2、期浸潤(rùn)可以加速糖尿病動(dòng)物全層皮膚缺損創(chuàng)面的愈合。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一類具有極大應(yīng)用前景的多能分化成體干細(xì)胞。目前許多研究證實(shí)BMSCs可以促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面血管新生、肉芽組織形成及再上皮化。但BMSCs與炎癥的關(guān)系十分復(fù)雜。目前發(fā)現(xiàn)BMSCs對(duì)淋巴細(xì)胞具有抑炎作用,但體外培養(yǎng)的 BMSCs在某些因素下可以釋放諸如 MIP-2、MCP-1等早期炎癥細(xì)胞的趨化因子。且越來(lái)越多的研究證實(shí)BMSCs功能受其所在微環(huán)境的影響

3、。在一氧化氮(NO)合成不足的微環(huán)境中,BMSCs反而可以促進(jìn)炎癥反應(yīng),這可能通過(guò)趨化因子起作用。既往研究顯示,糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷前后就可能處于NO低水平狀態(tài)。而體外實(shí)驗(yàn)提示BMSCs可能能夠提高血管內(nèi)皮細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞NO的表達(dá)。綜上所述,BMSCs對(duì)炎癥具有調(diào)節(jié)作用,但糖尿病創(chuàng)面愈合階段可能存在的不同的微環(huán)境可能使注射到創(chuàng)面的BMSCs對(duì)炎癥的具體作用不同。目前BMSCs對(duì)糖尿病創(chuàng)面炎癥作用的研究大多觀察的是T細(xì)胞或B細(xì)胞的結(jié)果,對(duì)

4、于創(chuàng)面愈合早期BMSCs對(duì)糖尿病創(chuàng)面PMNs和MΦ浸潤(rùn)的影響及機(jī)制尚不十分明確。
　　研究目的
　　本實(shí)驗(yàn)選用自發(fā)突變糖尿病小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,了解糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合特點(diǎn),研究創(chuàng)面局部皮下注射同源異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的影響,重點(diǎn)對(duì) BMSCs對(duì)創(chuàng)面中心粒細(xì)胞(PMNs)及巨噬細(xì)胞(MΦ)浸潤(rùn)及相應(yīng)趨化因子MIP-2和MCP-1表達(dá)的影響進(jìn)行研究。為研究BMSCs對(duì)糖尿病創(chuàng)面早期炎癥細(xì)胞

5、(PMNs和MΦ)的作用提供參考,且為我們進(jìn)一步研究BMSCs在促糖尿病創(chuàng)面愈合機(jī)制與應(yīng)用研究提供思路。
　　研究方法
　　1.采用全骨髓培養(yǎng)法分離C57B/6小鼠后肢股骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并純化擴(kuò)增。用誘導(dǎo)成骨、成脂分化實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)(檢測(cè)CD29,CD34,CD45,CD105)進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定。
　　2. C57BLKS/Nju背景自發(fā)突變糖尿病雄性小鼠( db/db小鼠)40只隨機(jī)分為BMSCs治療組(實(shí)

6、驗(yàn)組)和 PBS治療組(對(duì)照組)。所有小鼠背部脊柱中線兩側(cè)對(duì)稱部位制作直徑0.8 cm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面。實(shí)驗(yàn)組于傷后當(dāng)天(第0天)向每個(gè)全層皮膚缺損創(chuàng)緣皮下注射BMSCs單細(xì)胞懸液0.1ml(由無(wú)菌PBS配制,約含BMSCs1X106個(gè)),對(duì)照組同法注射等體積無(wú)菌PBS溶液。
　　3.分別于創(chuàng)面形成后第1、3、5、7、10、14天觀察創(chuàng)面愈合情況,照相后IPP6.0圖像分析軟件測(cè)算創(chuàng)面愈合率;并于創(chuàng)區(qū)取材,用HE染色觀察創(chuàng)面

7、愈合情況(炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肉芽組織形成、再上皮化、新生血管數(shù)量)。用抗 Ly-6 g單克隆抗體和抗 F4/80單克隆抗體免疫組化染色后采用 IPP6.0病理圖像分析軟件測(cè)定光密度值(OD)法檢測(cè)傷后第1、3、5、7、10天創(chuàng)面PMNs和第3、5、7、10、14天 MΦ浸潤(rùn)情況;用 qRT-PCR相對(duì)定量法檢測(cè)第1、3、5、7天創(chuàng)面組織中趨化因子MIP-2和MCP-1 mRNA的表達(dá)。
　　研究結(jié)果
　　1.成功分離小鼠骨髓間充

8、質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)且純化擴(kuò)增。分離的BMSCs表達(dá)正常的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD105(81.53％),CD29(71.26%),造血系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞表面標(biāo)志 CD34、CD45表達(dá)陰性,并能夠被誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞方向分化。
　　2. BMSCs治療組創(chuàng)面愈合時(shí)間(11.67±0.58)d明顯較 PBS對(duì)照組縮短(16.33±0.58)d( P<0.05)。BMSCs治療組第5、7、10天創(chuàng)面愈合率為(40.15±3.63)

9、%、(67.62±1.58)%、(98.28±1.51)%,對(duì)照組第5、7、10天創(chuàng)面愈合率為(18.52±3.19)%、(49.58±3.39)%、(78.52±6.52)%。實(shí)驗(yàn)組愈合率明顯提高。HE染色結(jié)果顯示BMSCs治療組較對(duì)照組第5、10天再上皮化程度明顯提高,肉芽組織形成量增多,新生血管形成增加。
　　3. BMSCs治療組和PBS對(duì)照組傷后第1天均出現(xiàn)PMNs浸潤(rùn),BMSCs治療組COD值較PBS對(duì)照組高(P<0.

10、01)。PBS對(duì)照組第3天時(shí)COD值下降,而第5天以后反有升高趨勢(shì)。BMSCs治療組COD值最高峰在創(chuàng)傷后第1天,且以后逐漸下降。BMSCs治療組MΦ浸潤(rùn)高峰均較對(duì)照組(PBS組)提前,且高峰值增高(P<0.01)。
　　4. BMSCs組MIP-2 mRNA,表達(dá)高峰在創(chuàng)傷后第1天,為對(duì)照組(30.91±8.30)倍(P﹤0.05),第5、7天分別為對(duì)照組(12.37±2.45)、(7.82±2.52)倍;MCP-1 mRNA表

11、達(dá)高峰在創(chuàng)傷后第3天,為對(duì)照組96.88倍(P﹤0.05),第1、5、7天分別為對(duì)照組(20.94±2.97)、(3.99±1.40)、(19.67±3.70)倍。
　　研究結(jié)論:
　　1. BMSCs增加糖尿病創(chuàng)面早期中性粒細(xì)胞(PMNs)浸潤(rùn)和巨噬細(xì)胞(MΦ)浸潤(rùn),為啟動(dòng)糖尿病小鼠全層皮膚缺損模型創(chuàng)面的修復(fù)過(guò)程提供了基礎(chǔ),可能進(jìn)而影響后期血管新生、上皮增殖遷移,肉芽組織形成等過(guò)程。
　　2. BMSCs能夠顯著提高