芪葵顆粒對(duì)趨化因子FKN在糖尿病腎病中表達(dá)影響的研究.pdf

1、糖尿病是呈逐年增長的內(nèi)分泌代謝疾病，其中約1/3患者最終發(fā)展為糖尿病腎病(DN)。DN是一種典型的糖尿病微血管并發(fā)癥，它的病變位置是腎臟，主要影響腎臟微血管，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬化。糖尿病腎病發(fā)病過程呈持續(xù)進(jìn)展性，伴隨著腎功能逐漸衰竭，最終導(dǎo)致死亡。很多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)DN的發(fā)生、發(fā)展過程受炎癥機(jī)制影響，趨化因子及其受體是炎癥細(xì)胞相互作用及募集的關(guān)鍵因素。Fractalkine(FKN)是目前CX3C類趨化因子中惟一的成員，具有趨化及粘附功能，參

2、與白細(xì)胞特別是吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的游走和活化，在DN的早期階段有重要的作用。
　　目的:
　　通過建立糖尿病腎病大鼠模型，觀察芪葵顆粒對(duì)糖尿病腎病(DN)大鼠的腎臟組織及高糖培養(yǎng)后的人腎系膜細(xì)胞（HRMC）中趨化因子FKN表達(dá)影響，探討其在治療糖尿病腎病時(shí)所可能產(chǎn)生的機(jī)制，為臨床治療糖尿病腎病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):使用35只健康雄性4周齡SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，高脂飼料喂養(yǎng)1月，造模前禁

3、食12h。隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組，n=8），糖尿病模型組（B組，n=9），中藥芪葵顆粒干預(yù)治療組（C組，n=9）及西藥厄貝沙坦干預(yù)組（D組，n=9）。B組、C組及D組大鼠予一次性腹腔注射大劑量鏈脲佐菌素(STZ)進(jìn)行誘導(dǎo)，建立DM大鼠模型，對(duì)照組A組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鹽緩沖液。造模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)3個(gè)月，測尿蛋白陽性作為作為DN模型成功指標(biāo)。每日用芪葵顆粒和厄貝沙坦分別對(duì)中藥組大鼠和厄貝沙坦組大鼠進(jìn)行灌胃干預(yù)。之后每2周測體重、血

4、糖一次。于實(shí)驗(yàn)第12周后，用代謝籠收集24h尿量，進(jìn)行尿蛋白測定及尿生化。然后處死大鼠，采取頸動(dòng)脈血測定腎功能，稱量腎重，觀察腎組織形態(tài)變化，采用RT-PCR方法、Western blot檢測法及免疫組織化法觀察糖尿病腎病大鼠腎臟的Fractalkine mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　2.體外實(shí)驗(yàn):制備含藥血清，將HRMC分為A組、B組、C組進(jìn)行培養(yǎng)。A組（生藥組）包括:NG(5mmol/L GLU)，Man（5mmol/l GLU

5、+25mmol/l甘露醇），HG（30mmol/l GLU），S2（30mmol/l GLU+2mg/ml生藥），S1(30mmol/lGLU+1mg/ml生藥)，S0.5（30mmol/L GLU+0.5mg/ml生藥）。B組（10％含藥血清組）包括:NLG1(10％正常血清+5mmol/l GLU)、NHG1(10％正常血清+30mmol/l GLU)、LLG1(10％低劑量含藥血清+5mmol/l GLU)、LHG1(10％低劑量

6、含藥血清+30mmol/l GLU)、HLG1(10％高劑量含藥血清+5mmol/lGLU)、HHG1（10％高劑量含藥血清+30mmol/l GLU）。C組（20％含藥血清組）包括:NLG2(20％正常血清+5mmol/l GLU)、NHG2(20％正常血清+30mmol/l GLU)、LLG2（20％低劑量含藥血清+5mmol/l GLU）、LHG2(20％低劑量含藥血清+30mmol/l GLU)、HLG2(20％高劑量含藥血清+

7、5mmol/lGLU)、HHG2(20％高劑量含藥血清+30mmol/l GLU)。使用western blot檢測法觀察高糖培養(yǎng)24h后Fractalkine蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)糖尿病腎病組大鼠24h尿蛋白、尿微量白蛋白/肌酐、腎重、腎重/體重比值、尿素氮、肌酐與正常對(duì)照組比較明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05);中藥治療組大鼠的尿蛋白、尿微量白蛋白/肌酐、腎重、腎重/體重比值、尿素氮、肌酐與同期糖

8、尿病腎病模型組大鼠相比明顯減少，具有顯著性差異(P＜0.05);厄貝沙坦組較模型組相比均明顯降低(P＜0.05);中藥組與厄貝沙坦組相比無明顯差異。給予芪葵顆粒治療后的腎皮質(zhì)FKN表達(dá)較模型組明顯下降(P＜0.05)。腎臟免疫組化結(jié)果示:中藥芪葵顆粒干預(yù)后的腎小球及腎小管間質(zhì)Fractalkine的表達(dá)量和模型組明顯減少，而中藥組和厄貝沙坦組相比較(P＞0.05)，無明顯差異。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)提示A組（生藥組）:與NG相比，F(xiàn)K

9、N蛋白表達(dá)在HG中明顯升高(P＜0.05);S2較HG的FKN蛋白表達(dá)升高(P＜0.05); Man和NG、HG中FKN蛋白表達(dá)相比無明顯差異;S1、S0.5和HG相比均無明顯差異。B組(10％含藥血清組):HHG1 Fractalkine蛋白表達(dá)水平較NHG1明顯降低(P＜0.05); HLG1fractalkine蛋白分泌較NLG1明顯降低(P＜0.05)。C組（20％含藥血清組）:HLG2Fractalkine蛋白分泌較NLG2明

10、顯升高(P＜0.05);與NHG2相比，HHG2 Fractalkine蛋白表達(dá)及分泌水平明顯降低(P＜0.05)
　　結(jié)論:
　　1.Fractalkine在糖尿病腎病組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，推測該趨化因子在DN炎癥反應(yīng)中起重要作用;2.中藥芪葵顆粒組與DM組相比，明顯降低糖尿病腎病大鼠的腎重/體重、尿蛋白、血肌酐、血糖，減少Fractalkine mRNA及蛋白的表達(dá)，推測芪葵顆粒對(duì)腎臟保護(hù)作用可能是通過下調(diào)Fractalk