整合素連接激酶在胎盤(pán)血管性疾病中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 ILK在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用
　　目的：
　　探討 ILK在子癇前期患者臍血 EPCs中的表達(dá)及其在新生血管形成中的作用。
　　方法：
　　1.分離、培養(yǎng)正常組和子癇前期組臍血 EPCs,利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫熒光吞噬功能(FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL)檢測(cè)鑒定;
　　2.采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)臍血 EPCs ILKmRNA的表達(dá);<

2、br>　　3.采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)臍血 EPCs ILK蛋白的表達(dá);
　　4.采用小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè) EPCs血管形成能力。
　　結(jié)果：
　　1.分離培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞,FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL雙陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs;
　　2.正常妊娠組 EPCs中ILKmRNA相對(duì)吸光度(A)值較子癇前期組顯著升高(0.64±0.05與0.45±0.06),子癇前期組輕度者較重度者顯著升高(0.47±0.0

3、7與0.39±0.08);
　　3.正常妊娠組 EPCs中ILK蛋白 A值較子癇前期組明顯升高(32±2與26±1),子癇前期組輕度者較重度者顯著升高(25±2與20±2);
　　4.正常妊娠組小管結(jié)構(gòu)形成的數(shù)量較子癇前期組顯著增多(330±8與135±7),子癇前期組重度者的小管形成的數(shù)量明顯少于輕度者(148±6與116±8)。
　　結(jié)論：
　　子癇前期患者 EPCs中ILKmRNA及其蛋白表達(dá)下降可能與子癇

4、前期的發(fā)生密切相關(guān)。
　　第二部分 ILK對(duì) EPCs與血管形成相關(guān)能力的作用
　　目的：
　　研究上調(diào) ILK的表達(dá)對(duì) EPCs細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成能力的影響,了解 ILK在 EPCs形成血管過(guò)程中的作用。
　　方法：
　　1.分離、培養(yǎng)重度子癇前期患者臍血 EPCs,將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染 Ad-GFP-ILK)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染 Ad-GFP)和空白對(duì)照組(不進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染)3組;
　　2.采

5、用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè) ILK mRNA的表達(dá);
　　3.采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè) ILK蛋白的表達(dá);
　　4.采用活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)比色法測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力;
　　5.采用Transwell模型遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的遷移能力;
　　6.采用重懸貼壁法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的分化能力；
　　7.采用小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的的管腔形成能力。
　

6、　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染后 EPCs中ILK mRNA和蛋白的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)組分別為0.831±0.14、0.78±0.12,分別與陰性對(duì)照組(分別為0.453±0.21、0.34±0.16)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組分別為(0.391±0.13、0.41±0.21),分別與陰性對(duì)照組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2.轉(zhuǎn)染24小時(shí)后 EPCs的增殖能力,實(shí)驗(yàn)組的積分吸光度(A)值為2

7、.343±0.027,與陰性對(duì)照組(1.625±0.033)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組為1.461±0.024,與陰性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3.轉(zhuǎn)染24小時(shí)后遷移入小室下室的細(xì)胞數(shù)目,實(shí)驗(yàn)組為(138.4±2.6)個(gè),高于陰性對(duì)照組(82.6±3.7)個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組為(95.3±4.2)個(gè),與陰性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。<

8、br>　　4.轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,分化成梭形細(xì)胞的數(shù)目,實(shí)驗(yàn)組為(546.1±6.3)個(gè),陰性對(duì)照組為(323.2±3.3)個(gè),空白對(duì)照組為(267.4±3.6)個(gè)。各組分別比較,實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　5.轉(zhuǎn)染24h后,各組 EPCs均未在 Matrigel上形成明顯的管腔網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),但實(shí)驗(yàn)組形成小管趨勢(shì)較對(duì)照組明顯。
　　結(jié)論：

9、　　ILK基因表達(dá)水平的升高可以影響 EPCs的增殖、遷移和小管形成能力。
　　第三部分 局部轉(zhuǎn)染 ILK改善 RUPP缺血模型大鼠胎盤(pán)灌注
　　目的：
　　通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)局部轉(zhuǎn)染模型大鼠胎盤(pán),觀察轉(zhuǎn)染 ILK基因后胎盤(pán)形態(tài)學(xué)和微血管密度等方面的變化,探討 ILK在改善孕鼠胎盤(pán)血管生長(zhǎng)的可能作用和機(jī)制。
　　方法：
　　1.建立孕鼠RUPP缺血模型;
　　2.模型鼠分組,并采用體內(nèi)腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將

10、過(guò)表達(dá) ILK的載體轉(zhuǎn)染入孕鼠胎盤(pán)組織;
　　3.轉(zhuǎn)染后的孕鼠組織行冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察 GFP表達(dá)以了解病毒的轉(zhuǎn)染效果;
　　4.測(cè)量孕17天大鼠轉(zhuǎn)染后胎盤(pán)的重量;
　　5.利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后孕鼠胎盤(pán)組織 ILK基因的mRNA水平表達(dá);
　　6.利用免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后孕鼠胎盤(pán)組織 ILK基因的蛋白水平表達(dá);
　　7.利用CD34因子免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)孕17天大鼠轉(zhuǎn)染后的胎盤(pán)血管密度

11、。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)選取的30只孕鼠,麻醉及感染死亡4只,早產(chǎn)1只;
　　2.轉(zhuǎn)染后胎盤(pán)組織的冰凍切片在熒光下觀察可見(jiàn) GFP大面積高表達(dá),體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果理想;
　　3.體內(nèi)轉(zhuǎn)染后,轉(zhuǎn)染組孕鼠的胎盤(pán)重量為(0.83±0.12)g,陰性對(duì)照組(0.86.±0.23)g,空白對(duì)照組(0.79.±0.41)g,轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組相相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);
　　4.轉(zhuǎn)染后各組胎盤(pán)中ILK mR

12、NA的表達(dá)水平,轉(zhuǎn)染組為1.352±0.31,陰性對(duì)照組為0.757±0.47,空白對(duì)照組為0.693±0.46。各組分別比較,實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組 ILK mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組 ILK mRNA的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);
　　5.轉(zhuǎn)染后各組胎盤(pán)中ILK蛋白的表達(dá)水平,轉(zhuǎn)染組為0.93±0.45,陰性對(duì)照組為0.48±0.32,空白對(duì)照組為0.54±0.41。實(shí)驗(yàn)組

13、與陰性對(duì)照組相比,ILK蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比,ILK蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);
　　6.轉(zhuǎn)染組孕鼠胎盤(pán)的微血管數(shù)量(78.4±5.03)較陰性對(duì)照組(64.2±3.15)顯著增多;陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組(60.1±6.34)相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　利用體內(nèi)腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)可有效增加 ILK基因在孕鼠胎盤(pán) mRNA和蛋