整合素連接激酶在喉鱗狀細胞癌發(fā)生中的作用及其與PTEN、AKT1-PKB關(guān)系的研究.pdf

1、喉部惡性腫瘤約占耳鼻咽喉惡性腫瘤的7.9％-35％。而喉部惡性腫瘤以鱗狀細胞癌最為多見，約占90％。近40年來，喉癌的發(fā)病率有增長趨勢。明確喉癌原因及機制，以期做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，進而提高社會效益，無疑有著重大意義。 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，許多癌基因和抑癌基因相關(guān)產(chǎn)物為細胞生長、增殖、分化等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成員。因此,新的觀點認為細胞癌變是由于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常，細胞接受了異常生長、增殖、分化信號所致

2、。細胞粘附移行的變化在腫瘤的形成、浸潤和播散中起重要作用。腫瘤細胞之間、腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)(ECM)，腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞的粘附是由不同的粘附分子來，介導(dǎo)的。 整合素(integrins)是所知的粘附分子中重要的一類，整合素和生長因子受體參與介導(dǎo)了這些相互作用，尤其是在上皮性腫瘤中，整合素在基底上層的表達與腫瘤的形成密切相關(guān)，其表達可預(yù)示臨床侵襲性病程的早期復(fù)發(fā)。而偶聯(lián)這些受體與下游組分的胞內(nèi)效應(yīng)物對胞外基質(zhì)的信號傳導(dǎo)起

3、到關(guān)鍵作用。整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)就是其中之一。在ILK高表達的上皮細胞中的細胞形態(tài)改變顯著特征是：在軟瓊脂中不依賴貼壁生長，對懸浮細胞凋亡的抑制，在胞外基質(zhì)中侵襲的增強，以及在裸鼠中成瘤。 AKT又稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。AKT與腫瘤發(fā)生有關(guān)，被逆轉(zhuǎn)錄病毒癌基因P13K變構(gòu)的細胞可表現(xiàn)出持續(xù)的AKT活性而易發(fā)

4、生癌變，而用顯性失活A(yù)KT等位基因轉(zhuǎn)染的這些細胞卻能逆轉(zhuǎn)其致癌的變構(gòu)，提示AKT與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。PTEN已被證實為一種人類腫瘤抑制因子，是一個蛋白和磷脂磷酸酶。目前研究顯示，ILK在PTEN依賴的細胞周期調(diào)控中起非常重要的作用。在許多人類癌癥中，PTEN具有極高的突變率。由于許多與癌癥相關(guān)的突變都位于PTEN磷酸酶催化結(jié)構(gòu)域，可以認為，PTEN磷酸酶活性對于其作為腫瘤抑制物的功能是必須的。研究證實，它的缺乏與AKT活性增加有關(guān)。

5、 關(guān)于ILK mRNA、ILK蛋白在喉鱗癌中表達的研究國內(nèi)外較少，而關(guān)于ILK、AKTl和PTEN在LSCC中的表達及其與LSCC侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究尚未見報道。本研究選取64例LSCC組織標本，應(yīng)用RT-PCR、免疫組化方法和原位雜交方法檢測了LSCC中ILK mRNA、AKTI和PTEN的表達，研究ILK、AKTl和PTEN與LSCC腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)指標的關(guān)系，并探討ILK、AKTl和PTEN參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的可能作用機制。

6、 實驗材料與方法 1．實驗材料 LSCC標本均來自中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院耳鼻喉科2003-2005年外科手術(shù)切除和活檢標本，共64例，聲門上癌56例，聲門癌8例。其中男性54例，女性lO例，年齡42～78歲，平均年齡60.5歲。所有頸廓清標本均做頸淋巴結(jié)連續(xù)切片。有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例。正常對照10例取白喉癌旁>2cm處正常喉黏膜組織。所有組織均分為兩份，一份做石蠟包埋，病理切片進行組織確認，另

7、一份在離體半小時內(nèi)放人預(yù)先處理過的錫箔紙中置液氮罐中，再轉(zhuǎn)存到-70℃冰箱保存。 2．實驗方法 (1)RT-PCR法檢測ILK的mRNA表達： 上游引物序列5’-GGA CCA CCG CAT CTC TAC AT-3’ 下游引物序列5’-GCA CTT TCT TCG CAG TTT CC-3’擴增的目的片段大小為338bp。 參照GAPDH基因檢測逆轉(zhuǎn)錄效率，其引物序列分別為上游引物序列5

8、’-CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA-3’ 下游引物序列5’-ATA CTG TTG TCG GAG TTC AGT A-3’，擴增的目的片段為450bp。 (2)原位雜交法檢測PTEN的基因表達。 (3)免疫組化法檢測ILK、AKTl的蛋白表達。 實驗結(jié)果 1．ILK mRNA在LSCC組織中的表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

9、2．ILK mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，且有顯著性差異(P<0.05)。 3．根據(jù)UICCl997年標準對LSCC進行TNM分期，隨著LSCC臨床TNM分期的發(fā)展，ILK mRNA的表達均相應(yīng)升高，但相鄰兩組間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 4．ILK蛋白在正常喉黏膜組織及LSCC組織中的表達結(jié)果： 在64例15CC組織中ILK蛋白陽性表達率為72.0％，而10例正常喉

10、黏膜組織上皮細胞無一例呈陽性表達，兩組間差異有顯著意義(P<0.05)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，其陽性表達為91.6％(33/36)，而無轉(zhuǎn)移組的表達為46.4％(13/28)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有顯著意義(P<0.05)。ILK蛋白陽性表達率與LSCC患者的臨床分期無明顯關(guān)系(P>0.05)。 5．ILK mRNA和ILK蛋白在LsCC組織中表達的比較： 采用RT-PCR方法對ILK mRNA進行半定量分析的結(jié)果與免疫組化分析

11、結(jié)果一致，即ILK在15CC組和對照組間均有顯著性差異，同時與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與15CC患者的臨床分期均無明顯關(guān)系。 6．AKTl蛋白在LSCC組織中陽性表達率為69.0％，而10例正常喉黏膜組織上皮細胞無一例呈AKTl陽性表達。AKTl蛋白陽性表達率與15CC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有無、臨床分期均無明顯關(guān)系(p>0.05)。 7．在LSCC組織中PTEN mRNA陽性表達率為14.0％，陽性染色主要定位

12、于癌細胞胞質(zhì)內(nèi)，少部分位于細胞核。VFEN mRNA在10例正常組織黏膜上表達均為陽性，表達率為100％。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 8．LSCC組織中AKTl和PTEN蛋白表達相關(guān)性分析 64例LSCC中，相關(guān)性分析顯示AKTI表達與ILK表達顯著正相關(guān)，而AKTl與PTEN、ILK與PTEN呈弱負相關(guān)。 1．ILK tuRNA和ILK蛋白在LSCC組織中呈過表達，并與有無淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)，提

13、示ILK與LSCC的發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 2．抑癌基因PTEN在LSCC的失表達可導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常，引起AKTl的過表達，與喉癌的發(fā)生相關(guān)。 3．ILK、AKTl及PTEN的表達情況可作為LSCC發(fā)生早期的診斷和轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標和LSCC患者預(yù)后的可參考指標。 4．通過對ILK、PTEN及AKTl的研究，提示我們可以尋求一種基因治療方法，恢復(fù)或替代缺失(突變)基因PTEN的功能，或抑制ILK的功能以阻止喉鱗癌的發(fā)