心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞在病毒性心臟病心肌纖維化中的作用及其機(jī)制.pdf

1、病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是心肌局限性或彌漫性的急性或慢性炎性病變。絕大多數(shù)患者預(yù)后良好;約10～15％的患者由于急性期后炎癥持續(xù)、病情遷延反復(fù)，進(jìn)展為擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)。在原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病中，高達(dá)60％的患者能檢測(cè)到病毒的感染。表明病毒感染是心肌炎心肌病重要的觸發(fā)因素之一。
　　心肌纖維化貫穿于VMC和DCM的各個(gè)階段，纖維化程度的高低與疾病的

2、預(yù)后和對(duì)藥物的反應(yīng)密切相關(guān)。心肌成纖維細(xì)胞活化是心肌纖維化最主要的始動(dòng)因素。既往研究認(rèn)為器官中的成纖維細(xì)胞絕大多數(shù)依靠組織中存在的固有成纖維細(xì)胞增生、活化;近年來(lái)不斷有研究證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞在某些病理狀態(tài)下，也能夠借由內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial to mesenchymal transition，Endo-MT)轉(zhuǎn)化為分泌細(xì)胞外基質(zhì)的肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)纖維化的發(fā)展。Endo-MT指的是在病理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞因子的作用下向間質(zhì)

3、細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其表型和功能均發(fā)生明顯改變;即內(nèi)皮細(xì)胞特異性的蛋白如血管鈣粘蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)和血管內(nèi)皮粘附分子1/CD31(platelet-endothelial cell adhesionmolecular-1/CD31)表達(dá)減弱甚至消失;而間質(zhì)細(xì)胞特異性的標(biāo)志物如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和成纖維細(xì)胞特異性蛋白1（

4、fibroblast-specific protein-1，F(xiàn)SP1）表達(dá)增多，脫離微血管腔面、遷移進(jìn)入組織，并獲得分泌膠原蛋白的能力。
　　多種病毒可引起心肌炎，尤以腸道病毒中的柯薩奇病毒B3(CoxsackievirusB3，CVB3)最為常見(jiàn)。CVB3主要經(jīng)呼吸道及消化道傳播疾病，其感染具有特殊性，需要兩次穿越內(nèi)皮細(xì)胞至靶器官。病毒通過(guò)消化道及呼吸道粘膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入外周血;之后病毒隨血流進(jìn)入冠脈微血管，穿越心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞

5、、感染心肌細(xì)胞。因而心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于病毒的嗜心性具有重要的選擇及保護(hù)作用;心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞是排列在心臟冠脈微血管內(nèi)的單層細(xì)胞層，是心肌細(xì)胞最重要和最后的一層保護(hù)屏障。在病理狀態(tài)下，心臟微血管內(nèi)皮還能分泌眾多細(xì)胞因子，維持心臟微環(huán)境的平衡穩(wěn)定。
　　既往我們關(guān)于病毒性心臟病的研究主要集中于病毒感染心肌細(xì)胞后引起的病理生理變化，忽略了心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞在病毒感染所致的心臟損傷中的作用。作為心肌細(xì)胞最后和最重要的一層保護(hù)屏障，本

6、研究在臨床DCM患者中發(fā)現(xiàn)Endo-MT對(duì)心肌纖維化的潛在作用的基礎(chǔ)上，鑒于病毒感染是心臟擴(kuò)大重要的觸發(fā)因素，我們圍繞著CVB3感染如何通過(guò)損傷心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)了心肌損傷及心肌纖維化，以及病毒感染引起的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在心肌炎心肌纖維化中的作用及可能的分子機(jī)制展開(kāi)研究。
　　第一部分:內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在擴(kuò)張型心肌病心肌重構(gòu)中的作用
　　[目的]：擴(kuò)張型心肌病以左室增大和心肌纖維化為特點(diǎn)。有報(bào)道表明內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endot

7、helial-to-mesenchymal transition，Endo-MT)參與動(dòng)物模型中器官纖維化的形成。本研究致力于闡明Endo-MT是否參與了DCM心肌纖維化的進(jìn)程。
　　[方法]：在40名DCM心臟移植患者的廢棄心肌組織和正常對(duì)照組心肌組織中采用免疫組化檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(CD31 and VE-cadherin)和成纖維細(xì)胞標(biāo)志物(α-SMA and FSP1)，并將此與患者的臨床資料特點(diǎn)進(jìn)行分析。使用共聚焦檢測(cè)內(nèi)

8、皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞標(biāo)志物共定位情況。免疫印跡法檢測(cè)Wnt、β-catenin和snail的蛋白水平。
　　[結(jié)果]：與正常對(duì)照心肌相比，患者病變心肌內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(CD31，P＜0.01;VE-cadherin, P＜0.01)明顯減少，而成纖維細(xì)胞標(biāo)志物(α-SMA，P＜0.01;VE-cadherin，P＜0.01)上升明顯。內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物與患者左室舒張末期內(nèi)徑呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)(CD31，r=-0.82，P＜0.01;VE-c

9、adherin，r=-0.73，P＜0.01);而成纖維細(xì)胞標(biāo)志物呈現(xiàn)中度正相關(guān)(α-SMA，r=0.65，P＜0.01;FSP1，r=0.53，P＜0.01)。免疫印跡顯示經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和snail蛋白水平均在病變心肌組織中升高明顯(P＜0.01)。
　　[結(jié)論]：本研究在患者DCM樣本中發(fā)現(xiàn)Endo-MT有可能為DCM心肌纖維化的潛在機(jī)制之一，其與DCM心室重塑具有相關(guān)性。Endo-MT的發(fā)現(xiàn)及其可能的對(duì)抗因子的出現(xiàn)為DC

10、M治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　第二部分柯薩奇病毒感染致心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損害及對(duì)心肌炎心肌纖維化的影響
　　[目的]：柯薩奇病毒(Coxsackievirus B3，CVB3)感染是病毒性心肌炎最常見(jiàn)的病原。CVB3病毒感染具有特殊性，需要兩次穿越血管內(nèi)皮至靶細(xì)胞;心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞正是病毒感染最重要和最后一層屏障，對(duì)病毒的嗜心性具有重要的選擇和保護(hù)作用。目前對(duì)CVB3病毒感染心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞研究較少。本研究探討CV

11、B3病毒對(duì)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的易感性及隨之而來(lái)的生物學(xué)改變，并觀察其在病毒性心肌炎心肌纖維化中可能的作用。體外微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性實(shí)驗(yàn)和電鏡證據(jù)均表明感染病毒后微血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能受到破壞。
　　[方法和結(jié)果]：qPCR法檢測(cè)感染病毒后CMVECs中病毒RNA的變化，發(fā)現(xiàn)從day0-day7，細(xì)胞內(nèi)CVB3的RNA持續(xù)性表達(dá)升高，這種病毒復(fù)制在48-72小時(shí)內(nèi)達(dá)到高峰(P＜0.01);TCID法檢測(cè)上清中的病毒滴度，顯示從感染

12、開(kāi)始至感染后第7天，上清中的病毒滴度始終波動(dòng)于10-4～10-6;說(shuō)明CMVECs是CVB3病毒的易感細(xì)胞，病毒RNA在CMVECs中能持續(xù)性復(fù)制，CMVECs在感染病毒后具有持續(xù)性釋放病毒的能力。采用流式檢測(cè)caspase3的活性，顯示病毒感染后第7天caspase3活性明顯上升(P＜0.01);病毒感染后Bax/Bcl-2的比值隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高，表明CVB3病毒能夠?qū)е翪MVECs增殖減低、凋亡增加。免疫印跡顯示感染病毒

13、后CMVECs持續(xù)性上升表達(dá)TGF-β1;使心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生Endo-MT轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨某衫w維細(xì)胞，并誘導(dǎo)鄰近的心肌細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，導(dǎo)致正常心肌結(jié)構(gòu)的破壞和異常細(xì)胞外間質(zhì)沉積，從而促進(jìn)心肌炎后心室重塑。
　　[結(jié)論]：本部分研究表明心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞也是CVB3病毒重要的宿主細(xì)胞之一;并能夠誘導(dǎo)眾多的生物學(xué)改變，有可能在急慢性病毒性心肌炎的心肌損傷和心肌纖維化中發(fā)揮了重要的作用。
　　第三部分:內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在病毒性心肌

14、炎心肌纖維化中的作用及其調(diào)控因子
　　[目的]：心肌纖維化貫穿于病毒性心肌炎各個(gè)階段，其程度與心肌炎的病程與預(yù)后密切相關(guān)。心臟成纖維細(xì)胞是心肌組織中分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，既往認(rèn)為其主要來(lái)源于心臟固有成纖維細(xì)胞。近年來(lái)報(bào)道內(nèi)皮細(xì)胞在損傷刺激下可以通過(guò)Endo-MT轉(zhuǎn)化為活化的成纖維細(xì)胞，參與心肌重塑。本部分就病毒感染引起的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在心肌炎心肌纖維化中的作用展開(kāi)研究，并尋找可能的調(diào)控因子。
　　[方法]：建立小鼠病毒性心

15、肌炎模型。采用小鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能;HE和天狼猩紅染色觀察心肌炎癥和膠原沉積;共聚焦檢測(cè)小鼠心肌中內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞標(biāo)志物的共定位情況;免疫印跡和細(xì)胞雙免疫熒光半定量心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá);qPCR法定量細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子的RNA含量。
　　[結(jié)果]：病毒感染14天后，小鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)心肌炎組小鼠心室腔增大、心室EF值降低。HE和SR染色顯示心肌炎組小鼠心肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出現(xiàn)灶性壞死，肌纖維排列不規(guī)則、

16、膠原沉積。共聚焦顯示心肌炎小鼠心肌中存在內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞標(biāo)志物共定位，即存在Endo-MT;而這種共定位在對(duì)照組小鼠中缺失。將SB431542加入培養(yǎng)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SB431542能夠減弱病毒感染引起的Endo-MT，并能使轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug基因表達(dá)下降;SB4315421是TGF-β1特異性抑制劑，表明感染病毒后心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生的Endo-MT是由其自身分泌的TGF-β1介導(dǎo)。
　　[結(jié)論]：本研

17、究在病毒性心肌炎模型小鼠中驗(yàn)證了Endo-MT是心肌炎后心肌纖維化的重要始動(dòng)因素，并推測(cè)出TGF-β1是該過(guò)程的重要調(diào)控因子。
　　第四部分:BMP7對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌纖維化的影響及其機(jī)制
　　[目的]：心肌纖維化是病毒性心肌炎的特征，與病程和預(yù)后密切相關(guān);逆轉(zhuǎn)纖維化進(jìn)程，有助于疾病的恢復(fù)。BMP7是TGF-β家族中的一員，認(rèn)為有抵抗TGF-β1的作用。本研究通過(guò)外源性的予以BMP7干預(yù)，觀察其對(duì)病毒性心肌炎小鼠心功能及

18、心肌纖維化的影響，并探討其可能的機(jī)制。
　　[方法]：qPCR法觀察病毒性心肌炎病程中BMP7和TGF-β1的表達(dá)量的變化;小動(dòng)物超聲心動(dòng)圖、HE和SR染色觀察BMP7干預(yù)后小鼠心功能的恢復(fù)、小鼠心肌炎癥浸潤(rùn)及膠原沉積情況。共聚焦檢測(cè)觀察BMP7干預(yù)后End-MT變化情況。免疫印跡分析可能的信號(hào)通路分子TGF-β1、p-smad3、smad3、smad4、Wnt和β-catenin的蛋白含量。
　　[結(jié)果]：qPCR法發(fā)現(xiàn)病

19、毒性心肌炎心肌組織中BMP/TGF-β1比值持續(xù)性下降。BMP7干預(yù)后，能提高小鼠生存率，心肌組織炎癥浸潤(rùn)和纖維化程度降低。BMP7能顯著降低心肌炎小鼠的Endo-MT、內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞標(biāo)志物共定位現(xiàn)象明顯降低。免疫印跡結(jié)果，BMP7能使心肌炎心肌組織中升高的TGF-β1、p-smad3、smad3、smad4和Wnt、β-catenin蛋白水平。
　　[結(jié)論]：本研究闡明了BMP7能夠延緩病毒性心肌炎心肌纖維化的進(jìn)程，其作用