Tribble 3在糖尿病心肌纖維化中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、心血管病變是糖尿病患者的主要死亡原因，在全部糖尿病患者中，約80﹪死于心血管病。1972年Rubler等首先在糖尿病患者中觀察到一種特殊的心功能障礙，這些患者無其他通常導(dǎo)致心功能減退的誘因如高血壓、冠心病、瓣膜病、先天性心臟病和酗酒等，尸檢也無動(dòng)脈粥樣硬化的證據(jù)。1974年，Hamby等首次提出了糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopahty，DCM)的概念，并認(rèn)為糖尿病心肌病變與糖尿病特有的代謝異常有關(guān)。其臨床特征早期以

2、心臟舒張功能不全、晚期以收縮功能不全為主，容易發(fā)生充血性心力衰竭?，F(xiàn)在流行病學(xué)和分子生物學(xué)等越來越多證據(jù)表明，糖尿病心肌病已被公認(rèn)是一個(gè)獨(dú)立的、特異的心肌疾病。近二十余年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)糖尿病心肌病進(jìn)行了大量研究，雖然取得了階段性研究成果，但糖尿病心肌病的發(fā)生機(jī)制仍未完全闡明。深入研究糖尿病心肌病的發(fā)生機(jī)制，探討阻斷糖尿病心肌病的發(fā)病途徑對(duì)糖尿病心肌病的防治具有深遠(yuǎn)意義。 糖尿病心肌病的發(fā)生涉及多種影響因素，心肌細(xì)胞代謝紊亂(如

3、葡萄糖、游離脂肪酸代謝紊亂)、微血管病變、心肌自主神經(jīng)病變、胰島素抵抗和氧化應(yīng)激等均促進(jìn)糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展。臨床研究表明，糖尿病心肌病通常以舒張性心力衰竭為早期表現(xiàn)，在糖尿病心肌組織形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞局灶性肥大、壞死，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積和心肌纖維化。以往對(duì)心肌細(xì)胞的研究較多，近年來心肌間質(zhì)重構(gòu)在糖尿病心肌病變中的作用逐漸引起人們的重視，但其詳細(xì)發(fā)生機(jī)制尚不明確。 Tribbles(TRBs)是新近在果蠅體內(nèi)發(fā)

4、現(xiàn)一種抑制有絲分裂的核基因，目前已知TRBs基因家族包括TRB1、TRB2、TRB3。晚近發(fā)現(xiàn)在空腹?fàn)顟B(tài)下，db-/db-小鼠(一種基因缺陷糖尿病小鼠)肝臟TRB3的mRNA及蛋白合成顯著增高，繼而導(dǎo)致空腹?fàn)顟B(tài)下肝糖輸出增多，血糖水平升高。此外，TRB3 Q84R位點(diǎn)錯(cuò)義多態(tài)性不僅和非糖尿病患者胰島素抵抗相關(guān)代謝異常有關(guān)，而且和糖尿病患者胰島素抵抗相關(guān)的心血管病危險(xiǎn)因素如高甘油三酯血癥、體重指數(shù)增高等有關(guān)。TRB3還可選擇性特異調(diào)控促分

5、裂原活化蛋白激酶(MAKPs)、NF-KB的活性。MAPKs及NF-KB信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、凋亡等生理反應(yīng)過程具有相當(dāng)重要的作用。MAPKs也是心肌纖維化病理進(jìn)程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。因此，TRB3可能不僅是糖尿病糖耐量異常的原因，而且可能參與糖尿病心肌病變的發(fā)生。然而，TRB3是否參與糖尿病相關(guān)并發(fā)癥如糖尿病心肌纖維化病變的病理生理過程，目前尚無報(bào)道。 目的 1．探討TRB3在糖尿病大鼠模型心肌中的表達(dá)。

6、 2．探討TRB3和糖尿病心肌纖維化病變的關(guān)系。 方法 雄性Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組(n=18只)，糖尿病組(n=18只)，正常對(duì)照組以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，糖尿病組，以高脂高熱量飼料喂養(yǎng)。四周后，糖尿病組以腹腔內(nèi)注射鏈脲菌素(STZ)30mg/Kg，正常對(duì)照組大鼠注射等量檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液。模型組動(dòng)物血糖升高后，繼續(xù)喂養(yǎng)16．周。實(shí)驗(yàn)過程中，進(jìn)行以下檢測(cè)：(1)每隔1周稱量體重1次，每隔2

7、周檢測(cè)空腹血糖1次。(2)分別于注射STZ前、注射STZ后1周、實(shí)驗(yàn)?zāi)┏檠獪y(cè)定空腹血糖、空腹胰島素、甘油三酯、膽固醇，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(1SI)。(3)分別于實(shí)驗(yàn)開始前、實(shí)驗(yàn)?zāi)┻M(jìn)行常規(guī)超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)定左房?jī)?nèi)徑、左室內(nèi)徑、右室內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。(4)于實(shí)驗(yàn)?zāi)┯涗浉鹘M大鼠心電圖，以心導(dǎo)管法進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)檢查，測(cè)定左室收縮末壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室上升最大速率(dp/dtmax)、左室下降升最大速

8、率(-dp/dtmax)，左室松弛時(shí)間常數(shù)(T)。(5)心肌組織超微結(jié)構(gòu)和病理學(xué)檢查。(6)應(yīng)用Masson染色進(jìn)行心肌組織間質(zhì)膠原定量。(7)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)TRBs mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況：實(shí)驗(yàn)過程中大鼠死亡3只，其中糖尿病組2只，死亡正常對(duì)照組1只，1只大鼠血糖未達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)，共32只大鼠最終完成實(shí)驗(yàn)。其中正常對(duì)照組17只，糖尿病組15只。 2.三組動(dòng)物體重及生化指標(biāo)測(cè)定：

9、 高脂高熱量飼料喂養(yǎng)4周后，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠體重明顯升高(P<0.05)，空腹血糖無明顯變化((P>0.05)，空腹胰島素明顯升高(P<0.05)胰島素敏感指數(shù)(ISI)明顯下降(P<0.01)，血清甘油三醋、血清膽固醇均明顯升高(P<0.05)。 STZ注射后1周，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，空腹血糖明顯升高(P<0.01)，空腹胰島素?zé)o顯著差異(P>0.05)；胰島素敏感

10、指數(shù)(ISI)明顯下降((P<0.01)；血清甘油三酷和血清膽固醇明顯升高(P<0.01)。 實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠體重明顯下降(P<0.01)；空腹血糖仍明顯升高(P<0.01)；空腹胰島素?zé)o明顯差異(P>0.05)；胰島素敏感指數(shù)(ISI)仍明顯下降(P<0.01)；血清甘油三醋和血清膽固醇仍明顯升高(P<0.01)。 3.超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)二尖瓣、三尖瓣返流情況：正常對(duì)照組17只動(dòng)物，均未見二尖瓣或三尖

11、瓣返流：糖尿病組組15只大鼠，輕度二尖瓣返流10只，中度二尖瓣返流5只，重度二尖瓣返流4只，輕度三尖瓣返流4只，中度三尖瓣返流6只，重度三尖瓣返流3只，其中5只二尖瓣、三尖瓣均存在返流，5只二尖瓣、三尖瓣均無返流。正常對(duì)照組無瓣膜返流發(fā)生，糖尿病組瓣膜返流發(fā)生率66.7﹪，明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。 常規(guī)超聲心動(dòng)圖指標(biāo)情況：血糖升高12周后，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組左房?jī)?nèi)徑明顯擴(kuò)大(P<0.01)，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF

12、)明顯降低(P<0.05)。 實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組左房?jī)?nèi)徑、左室內(nèi)徑、右室內(nèi)徑均明顯擴(kuò)大(P<0.05)，LVEF明顯降低(P<0.05)。 4.心電圖變化正常對(duì)照組17只大鼠心電圖均基本正常，糖尿病組13只大鼠心電圖出現(xiàn)異常，其中10只出現(xiàn)以QRS波正負(fù)交替變化為特征的心電圖改變，4只出現(xiàn)復(fù)雜心律失常(二種以上的心電圖異?；?qū)挻蠡蔚腝RS波)。正常對(duì)照組無心律失常發(fā)生，糖尿病組心律失常發(fā)生率86．7﹪。

13、Fisher檢驗(yàn)顯示：與正常對(duì)照組相比，糖尿病組心律失常發(fā)生率明顯增加(P<0.01)。 5．血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)與正常對(duì)照組相比，糖尿病組組LVSP明顯下降(P<0.01)，LVEDP明顯升高(P<0.01)，dp-／dtmax、-dp／dtmax明顯下降(P<0.01)，T明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。 6．透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)的改變正常對(duì)照組左室心肌組織細(xì)胞排列整齊，心肌細(xì)胞質(zhì)膜連續(xù)、完整；粗細(xì)肌絲排列整齊，細(xì)胞間質(zhì)可見成纖維細(xì)胞和

14、少量膠原纖維；微血管管腔大小正常，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。 糖尿病組左室心肌組織細(xì)胞排列紊亂，質(zhì)膜模糊、斷裂；肌原纖維呈灶性溶解，肌絲扭曲、斷裂，肌節(jié)對(duì)位不齊；間質(zhì)可見大量膠原纖維分布；微血管管腔狹窄，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯，呈柱狀向管腔突起。 7．組織病理觀察：HE染色切片上，正常對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，DCM組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大小不甚規(guī)則，可見肌纖維斷裂、排列紊亂。 8．Masson染色膠原含量的檢測(cè)：

15、正常對(duì)照組左室膠原組織分布均勻，相鄰細(xì)胞的膠原纖維網(wǎng)完好；糖尿病組心肌內(nèi)膠原組織明顯增多，圍繞心肌細(xì)胞的膠原纖維網(wǎng)斷裂、排列紊亂。定量分析顯示：與正常對(duì)照組相比，糖尿病組左室心肌組織膠原含量明顯升高(P<0.01)，相關(guān)性分析顯示：糖尿病組大鼠的左室心肌組織膠原含量與空腹血糖呈明顯的正相關(guān)(r為0．746，P<0.01)。 9．實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)TRBs mRNA表達(dá)： 與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠左室心肌TRB1m

16、RNA和TRB2mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TRB1mRNA：1．5±0.2 vs1．0±0.18，TRB2mRNA：1．37±0．15 vs1．0±0．13，P>0.05)；與正常對(duì)照組相比，糖尿病組左室心肌組織中TRB3的mRNA表達(dá)增高5．6倍(P<0.01)。 10．兩組大鼠左室心肌TRBs mRNA表達(dá)水平和血糖水平及左室心肌組織膠原含量的相關(guān)性： 相關(guān)性分析顯示：糖尿病組大鼠的心肌組織TRB3的mRN

17、A表達(dá)與血糖正相關(guān)(r=0.69，P<0.05)，與心肌組織膠原含量正相關(guān)(r=0.67，P<0.05)。 結(jié)論 1．應(yīng)用高熱量飲食喂飼和小劑量STZ注射，通過超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)，組織病理檢查等技術(shù)，成功地建立了符合2型糖尿病代謝特點(diǎn)的糖尿病大鼠模型，為糖尿病心肌病變發(fā)病機(jī)制的研究提供了可靠的研究模型。 2．膠原沉積增加，心肌間質(zhì)纖維化，是糖尿病心肌病變的主要組織病理變化。 3．在大鼠心肌中TRBs各亞族基因