甲基蓮心堿對(duì)糖尿病心肌纖維化的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題。糖尿病作為早產(chǎn)和死亡的主要原因，能夠增加心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致心肌重塑和心力衰竭。心肌纖維化是伴隨糖尿病常見(jiàn)的一種病理過(guò)程，在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。心肌纖維化導(dǎo)致心肌重構(gòu)，增加心肌的僵硬度，降低心臟泵送能力，最終導(dǎo)致心力衰竭。然而，迄今為止還沒(méi)有針對(duì)心肌纖維化的有效治療方法。
　　心肌成纖維細(xì)胞(cardiacfibrobl

2、asts，CFs)是心臟中的主要細(xì)胞類(lèi)型，在正常的心臟中負(fù)責(zé)基底細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的沉積和降解。作為基質(zhì)的主要分泌細(xì)胞，心肌成纖維細(xì)胞是參與心肌纖維化至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。心肌成纖維細(xì)胞在各種刺激下能夠發(fā)生一系列變化，如增殖、遷移、細(xì)胞分化、生成和降解細(xì)胞外基質(zhì)，分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等。高糖(highglucose，HG)是糖尿病的主要特征，已被證實(shí)在體外能夠誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖和活化以及刺激膠原

3、的沉積。在這些概念的基礎(chǔ)上，針對(duì)心肌成纖維細(xì)胞活化抑制心肌纖維化的治療是可靠的戰(zhàn)略要點(diǎn)。
　　“蓮子心”，來(lái)自中國(guó)植物蓮種子的胚，是一種中醫(yī)常用的鎮(zhèn)靜、解熱、止血?jiǎng)?。甲基蓮心堿是來(lái)自蓮子心的一種雙芐基異喹啉類(lèi)生物堿，與蓮心堿和異蓮心堿同分異構(gòu)。到目前為止，各種研究表明，甲基蓮心堿具有多種生物活性和藥理作用，如抗高血壓、抗心律失常，抗凝集、抗血栓形成，抗氧化，抗炎，抗癌能力，負(fù)性肌力作用和松弛血管平滑肌等。研究發(fā)現(xiàn)，甲基蓮心堿不僅具

4、有抗肝纖維化的作用，還能夠減輕博萊霉素誘導(dǎo)的體外和體內(nèi)的肺纖維化，對(duì)胺碘酮導(dǎo)致的肺纖維化同樣具有顯著的抑制作用。最近的一項(xiàng)研究表明，甲基蓮心堿可以減輕CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，并能夠降低肝內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)。1因此，我們當(dāng)前研究的目的是明確甲基蓮心堿能否減輕高血糖所致的心肌纖維化并深入探討其分子機(jī)制，以期提供可供選擇的、安全的臨床藥物。
　　研究目的
　　1.研究甲基蓮心堿對(duì)糖尿病小鼠心肌纖維化的作用及機(jī)

5、制;
　　2.研究甲基蓮心堿對(duì)高糖刺激心肌成纖維細(xì)胞增殖、遷移及合成膠原能力的影響。
　　研究方法
　　第一部分
　　1.動(dòng)物模型建立及甲基蓮心堿體內(nèi)給藥
　　將8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為STZ組（45只）和正常對(duì)照組(15只)。造模方法為:連續(xù)腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液5天，用藥劑量為60mg/kg/d，通過(guò)此方法誘導(dǎo)模型組小鼠產(chǎn)生糖尿病。對(duì)照組小鼠根據(jù)ST

6、Z用藥的劑量、體積相應(yīng)注射同體積的無(wú)菌檸檬酸鹽緩沖液(PH4.5)，濃度為0.1mmol/1。注射STZ溶液1周后，尾靜脈取血測(cè)量小鼠隨機(jī)血糖，并且將尾靜脈隨機(jī)血糖濃度大于18mmol/1的小鼠納入糖尿病模型組，并隨機(jī)分為3組:甲基蓮心堿低劑量組(60mg/kg/d)、甲基蓮心堿高劑量組(120mg/kg/d)、模型組。甲基蓮心堿藥物從實(shí)驗(yàn)第4周末開(kāi)始以灌胃的方式給藥，每日兩次，對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃。
　　2.血壓和心率檢

7、測(cè)
　　在小鼠取材前，應(yīng)用tai卜cuff方法，于安靜、保暖狀態(tài)下測(cè)量3次以上小鼠的尾靜脈收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓和心率，取其平均值統(tǒng)計(jì)。
　　3.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能
　　小鼠取材前，選用專(zhuān)業(yè)人員運(yùn)用二維、M超、脈沖多普勒和組織多普勒超聲成像技術(shù)評(píng)價(jià)小鼠的心臟左室功能。
　　4.透射電鏡觀察心肌的超微結(jié)構(gòu)
　　將新鮮的心臟迅速取出，左心室切割成1mm3的塊狀，以備透射電鏡觀察。
　　5.組織學(xué)染色

8、
　　用甲醛固定小鼠心臟，經(jīng)沖洗、脫水、石蠟包埋后制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟后進(jìn)行天狼猩紅、HE、Masson染色，觀察心臟的大體形態(tài)和膠原含量。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色，觀察心肌組織內(nèi)因子的分布和表達(dá)情況。
　　第二部分
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　本實(shí)驗(yàn)利用剛出生1～3天的C57小鼠的心臟，采用心臟分離和培養(yǎng)的方法得到左室心肌成纖維細(xì)胞。
　　2.實(shí)時(shí)定量RT-PCR
　　提取組織和細(xì)胞RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，利用實(shí)

9、時(shí)定量RT-PCR方法測(cè)定組織和細(xì)胞的mRNA水平。
　　3.蛋白免疫印跡
　　收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取，按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行試驗(yàn)。
　　4.細(xì)胞的增殖和遷移實(shí)驗(yàn)
　　采用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞的增殖率，利用Transwell小室觀察細(xì)胞的遷移情況。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　應(yīng)用SPSS18.0軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，圖示中連續(xù)變量以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間的變量運(yùn)用單因素方差分析檢驗(yàn)。尸小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果
　　第一部分
　　1.小鼠的一般特性
　　經(jīng)過(guò)STZ誘導(dǎo)、普通飲食后，糖尿病小鼠隨機(jī)血糖明顯高于正常對(duì)照組小鼠。糖尿病小鼠收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓明顯高于正常對(duì)照組小鼠，心率低于正常小鼠。然而，低劑量或高劑量的甲基蓮心堿藥物干預(yù)，對(duì)上述指標(biāo)沒(méi)有明顯作用，說(shuō)明甲基蓮心堿改善糖尿病心肌病并不是通過(guò)降低血糖實(shí)現(xiàn)的。
　　2.甲基蓮心堿能夠減輕糖尿病小鼠的心肌重塑及心功能異常
　　

11、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，高、低劑量的甲基蓮心堿給藥12周，觀察四組小鼠左心室肥大情況。糖尿病組小鼠與正常組小鼠比較表現(xiàn)為心臟變大、心尖圓鈍。給予甲基蓮心堿藥物組小鼠心臟大小、形態(tài)明顯改善。通過(guò)測(cè)量心、肺重量及脛骨長(zhǎng)度，甲基蓮心堿藥物降低了糖尿病小鼠的心臟脛骨重量長(zhǎng)度比(HW/TL)和肺臟脛骨重量長(zhǎng)度比(LW/TL)，減少心肌細(xì)胞面積。與正常組小鼠相比，糖尿病組小鼠心肌線粒體形態(tài)學(xué)改變，呈現(xiàn)嵴碎裂和無(wú)序的Z-線結(jié)構(gòu)。低劑量或高劑量的甲基蓮心堿治療減輕

12、線粒體腫脹、嵴碎裂和Z線結(jié)構(gòu)損傷。超聲心動(dòng)圖顯示糖尿病小鼠心功能下降，左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，短軸縮短率(FS)和早晚期二尖瓣流入血流速度比(E/A)均降低，而甲基蓮心堿治療可提高上述心功能參數(shù)，改善糖尿病小鼠心功能。
　　3.甲基蓮心堿能夠減輕糖尿病小鼠的心肌纖維化
　　Masson染色以及天狼猩紅染色顯示糖尿病小鼠出現(xiàn)明顯的心肌纖維化;根據(jù)免疫組織化學(xué)染色和免疫印跡技術(shù)顯示糖尿病小鼠左心室心臟組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原和TG

13、F-β1表達(dá)增加;甲基蓮心堿能夠減低心肌組織膠原含量及Ⅰ型、Ⅲ型膠原和TGF-β1表達(dá)。
　　4.甲基蓮心堿減輕糖尿病小鼠心肌組織ICAM-1、VCAM-1、TNF-α的表達(dá)
　　蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比，糖尿病小鼠炎癥因子TNF-α、促炎因子ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)顯著增多。低或高劑量的甲基蓮心堿干預(yù)后，糖尿病小鼠心肌組織TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)明顯減少。
　　第二部分

14、r>　　1.甲基蓮心堿抑制高糖刺激的心肌成纖維細(xì)胞的增殖
　　高糖(30mmol/1)刺激心肌成纖維細(xì)胞作用不同的時(shí)間(24h、48h、72h)，與正常對(duì)照組相比，均能促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的增殖，分別用不同濃度的甲基蓮心堿(1μM，2μM，5μM)干預(yù)，均能夠抑制高糖刺激的成纖維細(xì)胞的增殖，其中2μM和5μM濃度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.甲基蓮心堿將心肌成纖維細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)周期阻滯在G1期
　　高糖促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞從G

15、1期向S期改變，甲基蓮心堿(2μM，5μM)作用48h后能夠增加G1期細(xì)胞比例，減少S期及G2期細(xì)胞比例。
　　3.甲基蓮心堿降低高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞膠原的分泌，減少TGF-β1的表達(dá)，抑制心肌成纖維細(xì)胞的遷移
　　甲基蓮心堿能夠抑制高糖刺激心肌成纖維細(xì)胞的膠原Ⅰ、膠原Ⅲ和TGF-β1的分泌，抑制高糖刺激的心肌成纖維細(xì)胞的遷移。
　　4.甲基蓮心堿作用于心肌成纖維細(xì)胞的相關(guān)信號(hào)通路
　　免疫印跡顯示高糖刺激的

16、心肌成纖維細(xì)胞Smad2/3、ERK1/2及p38的磷酸化水平增高，甲基蓮心堿處理能夠降低細(xì)胞Smad2/3、ERK1/2及p38的磷酸化水平。
　　研究結(jié)論
　　1.甲基蓮心堿能夠改善糖尿病小鼠心肌重構(gòu)、心功能障礙及心肌纖維化程度;
　　2.甲基蓮心堿能夠減輕糖尿病小鼠心臟炎癥反應(yīng);
　　3.甲基蓮心堿能夠抑制高糖誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的增殖、遷移及膠原分泌，抑制心肌成纖維細(xì)胞的活化;
　　4.甲基蓮心堿通