Urocortin對糖尿病大鼠心肌纖維化及高糖誘導心肌細胞肥大的影響及機制.pdf

1、目的:
　　本研究首先采用糖尿病心肌病變(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)大鼠模型，研究內(nèi)分泌血管活性肽優(yōu)洛可啶(Urocortin)對DCM大鼠血清生化指標、血流動力學、心肌細胞內(nèi)鈣離子水平及心肌重構(gòu)的影響，探討Urocortin對DCM大鼠心肌肥厚和纖維化的保護作用及其可能機制。另外，研究了Urocortin對高糖(High glucose，HG)誘導的乳大鼠心肌細胞肥大作用的影響，探討Urocorti

2、n對心肌細胞內(nèi)熒光鈣離子含量([Ca2+]i)瞬間變化及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin，CaN)表達的影響，從而闡明Urocortin對HG誘導心肌細胞肥大的保護作用。研究Urocortin可抑制HG誘導心肌細胞肥大的作用呈劑量依賴性，其保護作用可能與抑制心肌細胞內(nèi)鈣含量及抑制CaN表達有關(guān)。本研究將為臨床防治DCM提供新的依據(jù)及理論基礎(chǔ)，為治療DCM提供新的藥物作用靶點。
　　方法:
　　1.在體實驗部分:

3、　　1.1 本部分實驗采用100只健康的雄性Wistar大鼠，隨機選取80只大鼠尾靜脈注射給予鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，55mg·kg-1，連續(xù)給藥3d，應用AccuCheck血糖儀監(jiān)測大鼠尾靜脈血糖，空腹血糖≥16.7 mmol·L-1視為DM大鼠造模成功。其余20只Wistar大鼠作為正常對照組（Control組）。上述DM大鼠造模成功后，飼養(yǎng)12周，造成DCM模型大鼠，剔除中間死亡鼠，將DCM大鼠隨機分為

4、4組，每組10只，包括:糖尿病心肌病變組（DCM組）、Urocortin藥物組（Urocortin7μ g·kg-1，UCN組）、Urocortin（7μg· kg-1）+Astressin（35μg·kg-1）組（UCN+AST組）和Urocortin（7μg·kg-1）+ Triciribine（0.5mg·kg-1）組（UCN+TRI組），每組實驗動物日一次腹腔注射相應受試藥物4周，DCM組日一次腹腔注射相等體積的生理鹽水。給藥期

5、間及給藥結(jié)束后觀察各組實驗動物一般狀態(tài)的改變。
　　1.2 上述各組受試實驗動物，給予相應藥物4周后，采用20％烏拉坦（1g·kg-1）麻醉上述各組實驗動物，應用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)分別測定各實驗組大鼠心臟功能狀態(tài);頸動脈取血2ml，測定下列指標。包括:測定各實驗組動物血清中C-肽、糖化血紅蛋白(Glycosylated hemoglobin，HbA1c)、肌酸激酶同工酶MB(Creatine kinase isoenz

6、yme-MB，CK-MB)、腦鈉肽(B-typenatriuretic peptide，BNP)。采用ELISA方法測定血清中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)、結(jié)締組織生長因子(Connectivetissue growth factor，CTGF)水平。
　　2.離體實驗部分:
　　2.1 本部分實驗采用新出生2～3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠

7、的乳鼠，體外原代培養(yǎng)乳大鼠心室肌細胞，應用高糖(HG，25 mmol·L-1)誘導心室肌細胞肥大，觀察不同濃度Urocortin對HG誘導的心肌細胞肥大的影響。將培養(yǎng)的乳大鼠心肌細胞隨機分成5組，包括:正常對照組（Normal組）、HG誘導的模型組（HG組）、Urocortin低劑量組（1μ mol·L-1，UCN-L組），Urocortin中劑量組（5μ mol·L-1，UCN-M組），Urocortin高劑量組（10μ mol·L-

8、1，UCN-H組）。
　　2.2 給予上述不同處理因素孵育48 h，用Lowry法檢測心肌細胞內(nèi)蛋白含量;消化分離法以及細胞圖像分析系統(tǒng)測量單個細胞的直徑，用球的體積公式計算細胞的體積;采用MTT檢測法測定各組心肌細胞的存活率;應用Till陽離子測定系統(tǒng)，并以Fura-2/AM為熒光探針，測定各組心肌細胞內(nèi)[Ca2+]i的瞬間變化;應用Western Blot方法測定CaN表達，CAMIAS008圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，即以C

9、aN/β-actin的IA比值表示CaN蛋白的相對表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.在體實驗結(jié)果:
　　1.1 與Control組相比，各實驗組DCM大鼠出現(xiàn)明顯的三多一少癥狀，活動減少、易感染。與DCM對照組相比，Urocortin受試組實驗動物狀態(tài)有所改善，體重增加，尿量減少，尿糖降低（P＜0.05)。
　　1.2 與Control組相比，各實驗組DCM大鼠左心室收縮壓(Left ventricularsyst

10、olic pressure，LVSP)和左心室舒張期末壓(Left ventricular diastolicfinal pressure，LVEDP)均明顯升高，左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)均顯降低，具有顯著性差異（P＜0.05);各實驗組大鼠血清C-肽水平明顯下降，HbA1c、CK-MB、BNP、TGF-β1、CTGF水平均明顯增高，與Control組相比有顯著性差異（P＜0.05);各實驗組大鼠HWI、LVM

11、I和急性分離的心肌細胞內(nèi)鈣離子水平均升高，與Control組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。與DCM對照組相比，Urocortin受試組大鼠LVSP和LVEDP均降低，±dp/dtmax均升高，血清HbA1c、CK-MB、BNP、TGF-β1、CTGF水平均降低;HWI、LVMI和心肌細胞內(nèi)鈣離子水平均降低，與DM組相比具有顯著性差異（P＜0.05)。另外，Astressin和Triciribine分別能阻斷Urocortin的上述

12、作用，與Urocortin受試組相比具有顯著性差異（P＜0.05)。
　　1.3 病理切片結(jié)果顯示，Control組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，肌纖維排列規(guī)則;DCM大鼠心肌細胞肥大變性，細胞間隙增寬，膠原纖維明顯增多，CVF明顯增高，與Control組相比具有顯著性差異（P＜0.05)。Urocortin能改善上述病理變化，CVF明顯降低，與DCM組相比具有顯著性差異（P＜0.05)。然而，經(jīng)Astressin和Triciribine

13、干預后，心肌細胞明顯損傷，肌纖維增粗，膠原增多，CVF增高，與Urocortin受試組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　2.離體實驗結(jié)果:
　　2.1 HG誘導的心肌細胞出現(xiàn)形態(tài)改變，皺縮，細胞拉長增大，數(shù)量顯著減少，在形態(tài)上趨向于成纖維細胞。給予不同濃度Urocortin，細胞形態(tài)和生長狀態(tài)趨于正常。
　　2.2 與Normal組相比，HG（25 mmol·L-1）組心肌細胞蛋白質(zhì)含量增加46.2％，體積增大

14、81.3％，心肌細胞存活率降低36.1％，具有顯著性差異（P＜0.01）。Urocortin不同濃度給藥組使HG誘導的心肌細胞總蛋白含量降低，細胞體積減小，心肌細胞存活率升高，與HG組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。其中，UCN-L組，心肌細胞的總蛋白含量、細胞體積分別降低6.8％，10.6％，心肌細胞存活率增加11.8％。與HG組相比，UCN-M及UCN-H組能顯著降低心肌細胞總蛋白含量、細胞體積，并能明顯升高心室肌細胞存活率（P

15、＜0.01）。不同濃度Urocortin實驗組，對上述實驗結(jié)果的影響呈劑量依賴性（r=0.94）。
　　2.3 與Normal組相比，HG組心肌細胞內(nèi)熒光[Ca2+]i瞬變增加62.5％，CaN表達顯著增加，具有顯著性差異（P＜0.01）。不同濃度Urocortin受試實驗組中心肌細胞內(nèi)熒光[Ca2+]i瞬間變化降低，CaN表達也減少，與HG組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。其中，Urocortin低、中、高濃度組對心肌細胞[

16、Ca2+]1瞬間變化和CaN蛋白表達的影響上呈劑量依賴性（r=0.95）。
　　結(jié)論:
　　1.Urocortin能改善DCM大鼠的一般狀態(tài)，改善DCM大鼠的心臟功能和血流動力學指標，降低HbA1c、CK-MB、BNP水平，對DCM具有治療作用。
　　2.Urocortin能減輕DCM大鼠心肌的病理改變，抑制心肌肥厚與纖維化，逆轉(zhuǎn)DCM大鼠心肌細胞的鈣超載，對DCM大鼠心肌組織具有保護作用。
　　3.Urocor