激活TGR5對高糖誘導(dǎo)乳小鼠心肌細(xì)胞肥大的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：糖尿病心肌病是糖尿病主要的心血管病變之一，心肌細(xì)胞肥大是其主要的病理變化之一，它在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。G-蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體5（Gprotein-coupled bile acid receptor5,TGR5）是一種新型的膽汁酸膜受體，在炎癥、糖脂代謝、能量代謝等方面起重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用高糖誘導(dǎo)乳小鼠心肌細(xì)胞肥大，探討激活TGR5對心肌細(xì)胞肥大的影響以及TGR5是否通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineuri

2、n,CaN)/活化T細(xì)胞核因子3（nuclear factor of activated T cells3,NFAT3）信號通路起作用，為以TGR5為靶點(diǎn)的糖尿病心臟并發(fā)癥的防治提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.原代乳小鼠心肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定采用兩步法分離消化細(xì)胞，聯(lián)合差速貼壁法（貼壁時(shí)間約70min）+化學(xué)試劑抑制法（在培養(yǎng)基中加5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5- bromodeoxyuridine,BrdU)來純化心肌細(xì)

3、胞，通過普通光學(xué)顯微鏡及免疫熒光染色法進(jìn)行心肌細(xì)胞鑒定。
　　2.摸索高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的最佳條件根據(jù)葡萄糖的不同濃度分為5組：正常對照組（Control5.5mmol/L葡萄糖）、低糖高滲組（HT5.5mmol/L葡萄糖+27.5mmol/L甘露醇），高糖組A（HG A,25mmol/L葡萄糖），高糖組B(HG B,33mmol/L葡萄糖),高糖組C(HG C,44mmol/L葡萄糖)作用時(shí)間24h，找出最適葡萄糖濃度范圍。以

4、最適的葡萄糖濃度（33mmol/L葡萄糖）再設(shè)置不同時(shí)間觀察點(diǎn)，分為4組：正常對照組(Control)、高糖刺激24h組(HG24h)、高糖刺激48h組(HG48h)、高糖刺激72h組(HG72h)，找到最適時(shí)間范圍。分別檢測各個(gè)實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞表面積、蛋白總含量以及肥大相關(guān)基因心房利鈉肽（atrial natriuretic polypeptide,ANP）、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)的表達(dá)

5、量。
　　3.有效TGR5腺病毒感染的篩選吸取細(xì)胞懸液100uL(濃度約為1×105個(gè)/mL)接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)48h，選取狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)是否加細(xì)胞感染增強(qiáng)液polybrene分為3組：空白組、病毒組、病毒+polybrene組；采用1/2體積感染法，感染心肌細(xì)胞72h后，通過熒光顯微鏡觀察紅色熒光的表達(dá)情況。
　　4.檢測TGR5在乳小鼠心肌細(xì)胞的表達(dá)情況通過腺病毒感染乳小鼠心肌細(xì)胞沉默TGR5的

6、表達(dá)，測定其TGR5 mRNA及蛋白表達(dá)量。
　　5.探究激活TGR5對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的影響及可能的作用機(jī)本實(shí)驗(yàn)采用 TGR5腺病毒(TGR5shRNA)、TGR5特異性激動劑6a-ethyl-23(S)-甲基膽汁酸(6a-ethyl-23(S)-methyl-cholicacid,S-EMCA,INT-777)以及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素（cyclosporine A,CsA）處理心肌細(xì)胞；分為5組：正常對照組(Cont

7、rol)、高糖組(HG)、高糖+INT-777組(HG+INT-777)、高糖+CsA組(HG+CsA)、高糖+INT-777+TGR5 shRNA組(HG+INT-777+TGR5shRNA)。分別檢測各個(gè)實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞表面積、蛋白總含量、肥大相關(guān)基因ANP、β-MHC的表達(dá)量，CaN及核NFAT3 mRNA、蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.通過臺盼藍(lán)染色普通光學(xué)顯微鏡檢及免疫熒光染色法，原代培養(yǎng)的細(xì)胞通過鑒定是心肌細(xì)胞

8、，存活率可達(dá)到98％以上，純度可達(dá)到95%以上。
　　2.與正常對照組相比，25mmol/L、33mmol/L、44mmol/L的高糖組心肌細(xì)胞表面積均增大、蛋白總含量均增加（P＜0.05），ANP、β-MHC mRNA的表達(dá)量均增加（P＜0.05）；而相較于正常對照組，低糖高滲組細(xì)胞表面積、蛋白總含量以及ANP、β-MHC mRNA的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論，予以葡萄糖濃度為33mmol/L的培養(yǎng)

9、基培養(yǎng)心肌細(xì)胞，設(shè)置三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，高糖刺激24h、48h、72h組均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞表面積增大、蛋白總含量增加（P＜0.05），ANP、β-MHC mRNA的表達(dá)量增加（P＜0.05）；其中以高糖刺激48h組細(xì)胞表面積、蛋白總含量及ANP、β-MHC mRNA的表達(dá)量最高。
　　3.在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光的表達(dá)，表明TGR5腺病毒成功感染心肌細(xì)胞；病毒+polybrene組感染心肌細(xì)胞的效果明顯優(yōu)于病毒組，以感染復(fù)數(shù)(m

10、ultiplicity of infection,MOI)等于100作為感染條件，感染效率可達(dá)到90%以上。
　　4.高糖使心肌細(xì)胞表面積明顯增大（P＜0.01）、蛋白總含量顯著增加（P＜0.01）以及CaN、核NFAT3的表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；INT-777能夠抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大、下調(diào)CaN的表達(dá)（P＜0.05）；INT-777或CsA均可下調(diào)核NFAT3的表達(dá)量（P＜0.05）；通過腺病毒感染心肌細(xì)胞沉默TG