白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷和凋亡的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景
　　隨著生活水平的提高，不良的飲食和生活習(xí)慣盛行，使得糖尿病的發(fā)病率迅速提高，已成為當(dāng)前威脅人類健康的最重要疾病之一。糖尿病的主要損害主要在于其引起的各種器官并發(fā)癥，其中以心血管并發(fā)癥的危害最重，是糖尿病患者死亡的主要原因。與非糖尿病正常心臟相比，糖尿病患者心臟更易受缺血性損傷，且損傷明顯加重，梗塞面積加大、心律失常增加。許多研究證實(shí)心肌細(xì)胞凋亡可能參與其中?？紤]到心肌細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，沒(méi)有再生增殖能力，長(zhǎng)期慢性的

2、凋亡使其數(shù)量逐漸減少會(huì)導(dǎo)致心臟泵功能降低直至心力衰竭。當(dāng)前的許多研究致力于闡明糖尿病引起心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，并尋找能抑制糖尿病心肌細(xì)胞凋亡的方法和藥物，進(jìn)而控制糖尿病的發(fā)展和各種并發(fā)癥的發(fā)生。
　　硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）系統(tǒng)是廣泛表達(dá)于機(jī)體各種細(xì)胞的一個(gè)重要的抗自由基系統(tǒng)，在很多涉及自由基損傷和凋亡的疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。我實(shí)驗(yàn)室前期用高糖高脂誘導(dǎo)結(jié)合STZ注射制成2型糖尿病大鼠在體模型和高糖高脂刺

3、激培養(yǎng)的成年大鼠心肌細(xì)胞以及H9C2心肌細(xì)胞離體模型上都觀察到明顯的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生。同時(shí)觀察到Trx硝基化、TR活性降低、TXNIP表達(dá)上調(diào)，伴隨糖尿病時(shí)Trx活性下降。。
　　白藜蘆醇（Resveratrol，RSV）多酚類化合物，是一類主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的多酚類化合物，由于其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、心血管保護(hù)，甚至抗衰老作用而受到極大的關(guān)注。近年來(lái)研究證實(shí)，白藜蘆醇具有一定的對(duì)抗糖尿病作用。白藜蘆醇可改善糖

4、尿病誘導(dǎo)的肝臟、胰腺以及腎臟損傷，減少胰島細(xì)胞凋亡并改善胰島素抵抗?！?】但目前對(duì)白藜蘆醇在糖尿病引起心肌細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制，以及在此過(guò)程中白藜蘆醇對(duì)Trx系統(tǒng)的影響的還缺乏研究。
　　目的
　　以高糖刺激的乳鼠心肌細(xì)胞模擬糖尿病誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，給予白藜蘆醇預(yù)處理觀察對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響，及其對(duì)硫氧還蛋白系統(tǒng)的影響。
　　材料與方法
　　1.乳鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)分組
　　將培養(yǎng)48h的乳

5、鼠心肌細(xì)胞分為三組：1）正常對(duì)照組：使用含葡萄糖5.5mmol/L的DMEM培養(yǎng)基加入甘露醇20mmol/L作為對(duì)照培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；2）高糖組：使用含葡萄糖25mmol/L的DMEM培養(yǎng)基作為高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；3）高糖+白藜蘆醇組：使用含葡萄糖25mmol/L的DMEM培養(yǎng)基加入終濃度30μmol/L的白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行45min預(yù)處理后換25mmol/L高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，各組細(xì)胞均繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞及培養(yǎng)基上清進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

6、
　　2.指標(biāo)檢測(cè)
　　測(cè)定培養(yǎng)基上清中乳酸脫氫酶（LDH）活性反映心肌細(xì)胞損傷情況，以標(biāo)記了FITC的AnnexinV作為熒光探針利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡程度，以胰島素還原法測(cè)定心肌細(xì)胞中Trx活性，使用ELISA對(duì)細(xì)胞內(nèi)3-硝基酪氨酸（3-NT)生成進(jìn)行測(cè)定，以Real-timePCR法測(cè)定心肌細(xì)胞TXNIP的mRNA水平，以WesternBlot法測(cè)定心肌細(xì)胞Trx1和TXNIP的蛋白表達(dá)，以DCFH-DA作為熒光探

7、針使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定丙二醛（MDA）含量以反映脂質(zhì)氧化水平。
　　結(jié)果
　　1.乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)48h后形態(tài)學(xué)觀察
　　接種48h后細(xì)胞形成細(xì)胞簇或細(xì)胞單層，貼壁細(xì)胞呈梭形、多角形，通過(guò)周邊突起的偽足相互交聯(lián)，鋪滿瓶底，呈放射狀排列的同心圓狀或峰谷樣生長(zhǎng)，細(xì)胞搏動(dòng)逐漸同步，收縮有力，于72h達(dá)高峰。
　　2.乳酸脫氫酶（LDH）活性測(cè)定
　　經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)

8、照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞的乳酸脫氫酶活性增高（1.978±0.609vs1±0.321,P<0.05），提示高糖可引起心肌細(xì)胞損傷；而白藜蘆醇預(yù)處理組，乳酸脫氫酶活性下降（1.105±0.305vs1.978±0.609,P<0.05），表明白藜蘆醇預(yù)處理能明顯減輕高糖對(duì)細(xì)胞的損傷。
　　3．流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡
　　結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增加(24.075±5.05

9、2vs9.993±1.971,P<0.05），給予白藜蘆醇預(yù)處理后凋亡減少(10.104±1.483vs24.075±5.052,P<0.05)，表明白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。
　　4．Trx活性分析
　　經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞Trx活性顯著降低(0.41±0.032vs1±0.025,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后高糖引起的Trx活性下降明顯得以改善(1.23±0.1

10、33vs0.41±0.032,P<0.05)。
　　5．Trx相對(duì)表達(dá)
　　結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組和白藜蘆醇預(yù)處理組乳鼠心肌細(xì)胞Trx1蛋白表達(dá)均未見(jiàn)明顯變化(1.001±0.018,0.832±0.03vs1±0.023,P>0.1)。
　　6.TXNIP相對(duì)表達(dá)
　　經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞TXNIP表達(dá)明顯增高(1.41±0.08vs1±0.125,P<0.0

11、5),給予白藜蘆醇預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了由高糖引起的TXNIP表達(dá)的改變(0.987±0.163vs1.41±0.08,P<0.05)。
　　7.TXNIPmRNA表達(dá)
　　經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞在培養(yǎng)48h后，TXNIPmRNA水平顯著增加(12.873±1.726vs1.00±0.00,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后TXNIPmRNA水平明顯降低(8.406±0.811vs12.873±1.72

12、6,P<0.05)。
　　該結(jié)果提示，給予白藜蘆醇預(yù)處理能有效逆轉(zhuǎn)由高糖引起的心肌細(xì)胞TXNIPmRNA水平的增加。
　　8．3-硝基酪氨酸含量測(cè)定
　　經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)3-硝基酪氨酸含量升高(16.978±0.20vs7.876±1.574,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后3-硝基酪氨酸含量降低(12.041±0.429vs16.978±0.20,P<0.05)。
　　

13、9．p38激酶活性分析
　　結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞p38激酶活性增高(1.437±0.09vs1±0.157,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后p38激酶活性降低(0.84±0.094vs1.437±0.09,P<0.05)。
　　10.活性氧（ROS）生成測(cè)定
　　經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞在培養(yǎng)48h后，細(xì)胞內(nèi)活性氧生成顯著增加(1.59±0.141vs1

14、±0.179,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后活性氧生成量降低(0.61±0.08vs1.59±0.141,P<0.05)。
　　該結(jié)果提示，給予白藜蘆醇預(yù)處理能明顯減少由高糖引起的心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧生成.
　　11．丙二醛（MDA）測(cè)定
　　經(jīng)檢測(cè)，與正常對(duì)照組心肌細(xì)胞相比，高糖組乳鼠心肌細(xì)胞在培養(yǎng)48h后，細(xì)胞內(nèi)MDA水平顯著增加(9.13±1.16vs5.83±0.178,P<0.05)，給予白藜蘆醇預(yù)處理后M

15、DA水平明顯降低(4.06±0.38vs9.13±1.16,P<0.05)。
　　該結(jié)果提示，給予白藜蘆醇預(yù)處理能有效減輕高糖誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。
　　結(jié)論
　　1.高糖可引起培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡，伴隨自由基產(chǎn)生、脂質(zhì)氧化損傷和Trx系統(tǒng)改變，Trx活性降低、TXNIP表達(dá)上調(diào)。
　　2.白藜蘆醇預(yù)處理可使Trx活性得到改善，高糖引起的TXNIP的表達(dá)明顯下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)活性氧生成、MDA含量、3-硝基