氯離子通道阻斷劑DIDS對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、隨著我國人口的老齡化及人群生活方式的改變,糖尿病在我國的發(fā)病率逐年升高,2010年流行病學(xué)研究顯示:糖尿病患病人數(shù)高達(dá)9240萬,成為我國重大的公共健康問題。調(diào)查顯示,糖尿病患者70％以上死于心血管系統(tǒng)疾病,是非糖尿病人群心血管疾病病死率的2～4倍。因此,糖尿病相關(guān)的心血管并發(fā)癥已成為糖尿病患者死亡的主要原因。目前,國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為糖尿病是心血管疾病的獨(dú)立危險因素。其中高血糖毒性是損害心臟及血管的主要因素,其造成損傷的程度與高血糖持續(xù)時間

2、及血糖的水平密切相關(guān)。研究顯示,高血糖是導(dǎo)致糖尿病患者心血管損傷最重要的啟動因素,長期高糖刺激不僅可導(dǎo)致機(jī)體腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)的激活,活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生,晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)及其受體(receptor for adva

3、nced glycation end products,RAGE)的增加,還可以激活炎性反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),從而依賴多種途徑加速心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和死亡。因此,探索高糖損害心肌細(xì)胞及血管的新機(jī)制,為糖尿病相關(guān)心血管并發(fā)癥的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)及措施是目前研究的熱點(diǎn)。
　　氯離子通道在全身各臟器及細(xì)胞廣泛表達(dá)。研究顯示氯離子通道不僅具有調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞容積,維持細(xì)胞靜息膜電位,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值,影響細(xì)胞增殖與分化等多種生

4、物學(xué)功能,還參與了RAAS系統(tǒng)激活和氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等重要的細(xì)胞病理生理過程。其中氯離子通道與細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):在細(xì)胞凋亡過程中必然出現(xiàn)細(xì)胞的皺縮,這一現(xiàn)象被稱之為凋亡性容積減少(apoptotic volume decrease,AVD)。電生理數(shù)據(jù)顯示該過程伴隨著鉀、氯通道負(fù)載的離子外流,氯通道阻斷劑能夠有效抑制受損細(xì)胞凋亡的發(fā)生。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在通過死亡受體途徑、

5、線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡模型中,容積敏感外向整流(volume-sensitive outwardly rectifying,VSOR)氯離子通道參與了心肌細(xì)胞的損傷過程,阻斷其通道可達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。那么,在糖尿病中高糖誘發(fā)的心肌損傷性機(jī)制中是否也有氯離子通道的參與?氯離子通道阻斷劑對其影響如何?基于此假設(shè),本實(shí)驗(yàn)擬在建立高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型的基礎(chǔ)上,通過檢測細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度、細(xì)胞存活率、ROS水平及凋亡相關(guān)

6、指標(biāo)變化探討氯離子通道對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響及ROS對其調(diào)控機(jī)制。
　　目的:
　　(1)原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,構(gòu)建高糖誘導(dǎo)的凋亡性損傷模型,確定實(shí)驗(yàn)高糖的最佳作用濃度及時間。
　　(2)檢測細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度變化,觀察高糖對細(xì)胞氯離子通道的影響,探討氯離子通道阻斷劑DIDS對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　(3)檢測高糖對 ROS的影響,探討 ROS與氯通道的關(guān)系,同時檢測氯離子通道阻斷劑DIDS對高

7、糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中ROS水平的影響。
　　方法:
　　(1)原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞及構(gòu)建高糖損傷模型:常規(guī)獲取SD大鼠新生乳鼠(0-3 d)心肌細(xì)胞,應(yīng)用差速貼壁法純化心肌細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。配制葡萄糖濃度為5.5、11、22、33、44 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基,分別處理0、24、48、72和96 h,摸索高糖損傷的最佳實(shí)驗(yàn)條件。
　　(2)實(shí)驗(yàn)分組A及檢測:分正常對照組、甘露醇組、高糖組、高糖+DIDS

8、組及DIDS組。氯離子熒光探針(MQAE)檢測細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的變化,MTT法檢測細(xì)胞存活率。
　　(3)實(shí)驗(yàn)分組B及檢測:分正常對照組、高糖組、高糖+DIDS組及DIDS組。流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率,蛋白免疫印跡法Western-blot檢測凋亡中pro-caspase-3蛋白的表達(dá),Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-3活性,熒光探針(DHE)檢測超氧化物陰離子水平。
　

9、　(4)實(shí)驗(yàn)分組C及檢測:分正常對照組、外源性加入ROS(H2O2)組、高糖組及高糖+N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC)(ROS清除劑)組,利用氯離子熒光探針MQAE檢測各組心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度變化。
　　結(jié)果:
　　(1)心肌細(xì)胞凋亡模型條件:按葡萄糖濃度為5.5、11、22、33、44 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基分別處理0、24、48、72和96 h后,心肌細(xì)胞存活率呈濃度及時間依賴性降

10、低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,n=6)。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷以凋亡形式為主。提示:33 mmol/L葡萄糖作用72 h,心肌細(xì)胞存活率為73.2%±4.1%,以此濃度和時間作為最佳的實(shí)驗(yàn)條件。
　　(2)高糖對心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的影響:MQAE檢測顯示,正常對照組與甘露醇組細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,n=5);高糖組與正常對照組比較,細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度顯著下降(P<0.05,n=5);高糖+D

11、IDS組與高糖組比較,細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,n=5)。
　　(3)高糖對心肌細(xì)胞存活率的影響:MTT檢測顯示,正常對照組與甘露醇組心肌細(xì)胞存活率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05,n=6);高糖組與正常對照組比較,心肌細(xì)胞存活率皆顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,n=6);高糖+DIDS組與高糖組相比心肌細(xì)胞存活率顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,n=6)。
　　(4) DIDS對

12、高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響:流式細(xì)胞計數(shù)及TUNEL染色檢測顯示,高糖組與正常對照組相比,細(xì)胞凋亡率明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,n=5);高糖+DIDS組與高糖組相比,細(xì)胞凋亡率明顯減少,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,n=5)。高糖組與正常對照組相比 pro-caspase-3蛋白表達(dá)明顯減少,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,n=5);高糖+DIDS組與高糖組相比pro-caspase-3蛋白表達(dá)明顯增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意

13、義(P<0.05,n=5)。高糖組與正常對照組相比 Caspase-3活性明顯升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,n=5);高糖+DIDS組與高糖組相比Caspase-3活性明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,n=5)。
　　(5) ROS對心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的影響:MQAE檢測顯示,H2O2組和高糖組與正常對照組相比,心肌細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度均顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,n=5)。高糖+NAC組中細(xì)胞內(nèi)氯離子

14、濃度相對于高糖組明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,n=5)。
　　(6) DIDS對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響:超氧化物熒光探針(DHE)檢測顯示,高糖組與正常對照組相比,心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,n=5);而高糖+DIDS組與高糖組相比,心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,n=5)。
　　結(jié)論:
　　(1)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過程中伴有