NRG-1在缺血-再灌注冠脈微血管內(nèi)皮細胞-心肌細胞之間的作用及其機制.pdf

1、背景及目的：
　　再灌注治療是缺血性心臟病發(fā)生急性血管堵塞時治療的關(guān)鍵，然而，再灌注常常并發(fā)缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/RI），可加重心肌損傷，導致病情惡化。I/RI的發(fā)生發(fā)展機制復雜，目前尚未完全闡明。內(nèi)皮細胞-心肌細胞的相互作用在調(diào)節(jié)心臟功能中占有重要地位，但其相互作用的機制仍不明確。研究顯示，內(nèi)皮細胞可以促進心肌細胞存活，減少缺氧復氧誘導的心肌細胞損傷。前期研究證實，I/RI

2、的發(fā)生與冠狀動脈微血管內(nèi)皮細胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）和心肌細胞的凋亡密切相關(guān)，我們前期研究顯示，胰島素通過抑制CMECs和心肌細胞的凋亡，從而保護缺血/再灌注心臟。但在此過程中，這兩種細胞之間的相互作用有待進一步研究。
　　神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1（neuregulin-1，NRG-1）是一種表皮生長因子，可以保護心臟并促進心臟發(fā)育成熟，主要由內(nèi)皮細胞合成釋放。但在I

3、/RI過程中，CMECs是否能釋放N RG-1，釋放的NRG-1是否能促進心肌細胞存活，尚未見報道。研究報道，NRG-1可作用于ErbB2受體激活ERK使其發(fā)生磷酸化，同時，ERK1/2可調(diào)節(jié)COX-2表達，對I/RI的心肌起保護作用。然而，在CMECs-心肌細胞共培養(yǎng)時，ERK是否在NRG-1保護缺血/再灌注心肌中起重要作用，以及ERK與COX-2是否有關(guān)聯(lián)仍不明確。因此，本實驗通過建立CMECs-心肌細胞相互作用的實驗模型，并模擬缺

4、血/再灌注損傷（simulated ischemia reperfusion，SI/R），觀察I/RI是否刺激CMECs釋放NRG-1，NRG-1是否可以保護缺血/再灌注心肌，并初步探討其發(fā)生機制。
　　方法：
　　1.分離培養(yǎng)大鼠冠脈微血管內(nèi)皮細胞和心肌細胞，建立模擬缺血/再灌注模型和CMECs-心肌細胞共培養(yǎng)實驗模型。根據(jù)研究對象的不同，CMECs隨機分為對照組，SI/R組和SI/R+Ins（10-7mol/L）組，并分

5、別收集各組的培養(yǎng)上清。而心肌細胞隨機分為以下7組：對照組，SI/R組，SI/R+Coculture（共培養(yǎng)）組，SI/R+Coculture+anti-ErbB2（ErbB2抑制劑）組，SI/R+NRG-1組，SI/R+NRG-1+anti-ErbB2組，SI/R+NRG-1+PD（ERK1/2抑制劑PD98059）組。
　　2.心肌細胞的活性和凋亡指數(shù)分別用 MTT法和TUNEL法檢測進行檢測，Western blot法檢測CM

6、ECs培養(yǎng)上清中NRG-1表達、心肌細胞ErbB2、ERK和COX-2蛋白或磷酸化水平，Caspase-3酶活性反應心肌細胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離培養(yǎng)CMECs和心肌細胞，并建立了SI/R模型和CMECs-心肌細胞共培養(yǎng)模型。
　　2.SI/R（4h/4h）組的心肌細胞活性比對照組明顯降低（P<0.01），而SI/R+Coculture組細胞活性較SI/R組升高（P=0.02）。CMECs進行SI/R（4

7、h/4h）處理后，誘導NRG-1的釋放（2.96±0.30），當給予胰島素時，NRG-1升高更顯著（4.62±0.26）（均為P<0.01）。檢測SI/R不同時間的NRG-1分泌量，4h/4h時分泌量較對照組增加最顯著（P<0.01）。心肌細胞SI/R組凋亡指數(shù)和Casp ase-3酶活性比對照組明顯升高（27.97±0.90比3.58±0.23，P<0.01；375.93±11.76比100.00±0.00，P<0.01）。共培養(yǎng)或N

8、RG-1處理細胞后，凋亡指數(shù)和Caspase-3酶活性較SI/R組降低（16.82±1.03比27.97±0.90，P<0.01；166.16±15.15比375.93±11.76，P<0.01），且ErbB2和ERK磷酸化水平以及COX-2表達明顯增加（均為P<0.01）。用ErbB2或ERK1/2抑制劑預處理心肌細胞后，共培養(yǎng)和NRG-1的作用消失（均為P<0.01）。
　　結(jié)論：I/RI時CMECs可以釋放NRG-1，誘導心