脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、HGF在缺血缺氧模型中對(duì)小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的影響.pdf

1、急性心肌梗死(AMI)后出現(xiàn)心肌細(xì)胞丟失和心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致患者心力衰竭進(jìn)展或臨床死亡。既往心肌重構(gòu)中殘留的心肌細(xì)胞肥大被大量地關(guān)注研究。近年來有關(guān)心肌梗死后壞死區(qū)間質(zhì)纖維化在心肌重構(gòu)中所起的作用也被廣泛研究。肌成纖維細(xì)胞的過度增殖是間質(zhì)纖維化的中心環(huán)節(jié)。人們針對(duì)刺激常見的刺激纖維化的因子進(jìn)行干預(yù)，未取得理想的抗纖維化效果，人們?cè)O(shè)想可能存在其他的引起纖維化的機(jī)制，在腎、肝、肺的纖維化過程中發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞的過度增殖除了可由原位成纖維細(xì)胞

2、的異常激活導(dǎo)致外，還可通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化而來(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。在心臟胚胎發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)EMT的另外一種形式---內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)。原位成纖維細(xì)胞的活化和EndMT可能共同導(dǎo)致心肌梗死后間質(zhì)纖維化。EndMT是由TGF-β1-Smad通路介導(dǎo)的，HGF可通過阻斷TGFβ1通路抑制EndMT及

3、成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化?；谏鲜鲅芯康陌l(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)EndMT可能也在心肌梗死后心肌間質(zhì)纖維化中扮演重要角色。我們?cè)O(shè)想，如果能找到一個(gè)既能替代心肌梗死后壞死的心肌細(xì)胞，又能分泌或攜帶HGF抑制EndMT和成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的辦法，有效抑制心肌梗死后心肌間質(zhì)纖維化，必將為心肌梗死后心肌重構(gòu)的改善，心肌梗死后心衰發(fā)生發(fā)展的防治提供新的研究和治療領(lǐng)域。
　　目的:研究脂肪干細(xì)胞(ADSCs)、HGF在缺血缺氧模型中對(duì)小鼠

4、心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的影響，為ADSCs聯(lián)合HGF以后初步應(yīng)用于臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法:一:脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定。分離小鼠脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，傳代擴(kuò)增后，監(jiān)測(cè)細(xì)胞活性，監(jiān)測(cè)細(xì)胞表型進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)分化。
　　二:微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定。分離與培養(yǎng)心臟組織來源的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，傳代擴(kuò)增后，監(jiān)測(cè)細(xì)胞活性，免疫熒光染色鑒定。
　　三:小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血缺氧模型的建立，ADSCs、HGF在

5、模型中對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的影響。將傳代培養(yǎng)的2代的微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種在35mm小培養(yǎng)皿中，待融合成完整細(xì)胞單層厚采用無菌Hank緩沖液進(jìn)行2次沖洗，加入Eaele液(含鈣低糖緩沖液)，輕輕將無菌石蠟油滴入Eaele液中，使其完整覆蓋在Eaele液中，放入37℃下，將各小培養(yǎng)皿放入在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為2組A組,shame組，B組為ADSCs-HGF組，于干擾后4天收集上清液，行ELASA，和Western-blot測(cè)定各組

6、上清液a-SMA、波形蛋白的表達(dá)水平。
　　四:在體ADSCs-HGF移植治療大鼠AMI.實(shí)驗(yàn)用SD大鼠，隨機(jī)分為2組，A組shame組，制備AMI后，用無菌微量注射器在梗死區(qū)邊緣心外膜下多點(diǎn)注射DMEM,每次50μml。B組ADSCs-HGF組，同樣的方法注射含有HGF的ADSCs細(xì)胞懸液，每次50μml(細(xì)胞數(shù)量為2.5×10個(gè)/50μml;HGF濃度為10ng/ml)，術(shù)后1月取心臟組織行免疫熒光雙標(biāo)染色。
　　結(jié)果:

7、ADSCs分離培養(yǎng)成功，表型鑒定CD29和CD90表達(dá)陽性，經(jīng)誘導(dǎo)可成功向骨、脂肪、心肌細(xì)胞分化。乳鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)成功，PAP法鑒定為內(nèi)皮細(xì)胞。微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血缺氧模型建立成功，觀察組中置入脂肪干細(xì)胞及HGF在缺氧缺血模型中減少a-SMA、波形蛋白的表達(dá)水平(P＜0.05)。在大鼠AMI模型切片中可見B組雙染細(xì)胞數(shù)量較A組減少。
　　結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)分離出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2、微血管