禽波氏桿菌ompA-IgY Fc融合蛋白表達及松花粉多糖對雞體免疫應答的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目前對于一些傳染性疾病，滅活苗和活苗已被廣泛應用，然而由于疫苗的滅活制備過程，使其抗原的物理及化學結構發(fā)生改變，從而影響了疫苗對機體的免疫保護能力。隨后，人們生產(chǎn)出的具有天然結構和統(tǒng)一快速生產(chǎn)特性的重組亞單位疫苗也被廣泛用于預防各種傳染性疾病，然而，由于重組亞單位疫苗在機體的快速清除等影響，使得蛋白質(zhì)或多肽通常具有較短的血清半衰期及有限的抗原刺激。因此為了更有效的控制禽類傳染病，亟需開辟新的途徑，研發(fā)新型疫苗。近年來，將哺乳動物免疫球蛋

2、白Fc與外源蛋白連接的融合技術已經(jīng)被開發(fā)出來，這種技術中IgG Fc片段的連接賦予了融合的外源蛋白質(zhì)或多肽類似抗體的特性，不僅增強了對抗原捕獲的速度和效率，同時還增強了融合蛋白的血清半衰期。然而對于融合表達的IgY Fc是否與融合表達的IgG Fc一樣，可以有效促進動物機體的非特異性免疫應答和特異性免疫應答，目前還沒有被研究。
　　因次，在本項研究中，實驗室以一種常見的可導致禽類呼吸道疾病的禽波氏桿菌（Borderella avi

3、um）中具有免疫原性的外膜蛋白A（ompA）為模型，使用巴斯德畢赤酵母GS115真核表達系統(tǒng)，表達連接有雞IgY Fc和禽波氏桿菌ompA的融合蛋白；首先檢測ompA-Fc融合蛋白對雞腹腔巨噬細胞活性的影響，以評價連接的Fc對雞體非特異性免疫應答的影響；再將融合蛋白免疫雛雞，以評價連接的Fc對特異性免疫應答的影響；此外，本實驗室經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)，泰山松花粉多糖(Taishan pinus massoniana pollen polysac

4、charide, TPPPS）作為一些滅活疫苗及亞單位疫苗的佐劑時表現(xiàn)出良好的免疫增強效果，因此，TPPPS作為一種免疫調(diào)節(jié)劑對巨噬細胞的活化，以及用作佐劑對融合蛋白的免疫增強效果也被探究。
　　本研究分以下三部分內(nèi)容：
　　1. ompA-Fc融合蛋白畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的構建，表達及產(chǎn)物分析
　　對GenBank中公布的禽波氏桿菌ompA及雞IgY Fc基因序列分別設計特異性引物，以本實驗室先前分離得到的禽波氏桿菌DNA

5、及本試驗提取的雞脾臟RNA為模板，采用SOE-PCR的方法進行重組基因的擴增。隨后對擴增后的重組基因連接轉(zhuǎn)化至pMD18-T克隆載體，同時基因測序鑒定重組克隆載體中重組基因序列，隨后利用限制性內(nèi)切酶Xho I和Not I對測序成功的重組克隆載體進行雙酶切及產(chǎn)物膠回收，隨后將回收產(chǎn)物與經(jīng)相同酶酶切后的表達載體pPIC9再次進行連接轉(zhuǎn)化。之后，將基因測序驗證正確的重組表達質(zhì)粒線性化，并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，對經(jīng)RDB板篩選的

6、陽性轉(zhuǎn)化子進行PCR鑒定及基因測序。與此同時，以轉(zhuǎn)化的空質(zhì)粒pPIC9載體做為陰性對照。對經(jīng) PCR檢測正確的畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子及空質(zhì)粒對照分別進行甲醇誘導表達。表達后的產(chǎn)物通過SDS-PAGE檢測分析，與蛋白凝膠層中陰性對照孔相比，在陽性孔中顯示有一條與目的蛋白分子量大小一致的約為47.4 kDa的條帶。畢赤酵母表達的融合蛋白在72 h獲得最大蛋白質(zhì)產(chǎn)量（18 mg/L）。隨后對表達的蛋白經(jīng)鎳柱進行純化，并且SDS-PAGE檢測分析中

7、同樣檢測到一條大小約為47.4 kDa蛋白條帶。
　　分別用抗His標簽抗體，大鼠抗omp多克隆抗體和兔抗雞IgG（HRP）進行Western blot分析以確定表達后融合蛋白的免疫原性。在這三次獨立DAB顯色測定后，均觀察到一條大小約47.4 kDa的目的條帶；經(jīng)對照確定該條帶與之前在SDS-PAGE檢測的條帶分子量大小一致。結果表明，表達的融合蛋白中IgY Fc和ompA保持其各自獨立的免疫原性。此外，本試驗通過SWISS-M

8、ODEL軟件利用同源建模方法預測融合后ompA-Fc蛋白的三維空間結構，發(fā)現(xiàn)融合蛋白中兩個蛋白在柔性肽的連接下分別進行各自空間結構的折疊相互不影響。此外，本實驗室先前構建的pPIC9-ompA表達質(zhì)粒用作本研究中的陰性對照，此表達質(zhì)粒表達的ompA蛋白的免疫原性也進行了驗證。
　　2. ompA-Fc融合蛋白與TPPPS對巨噬細胞活力影響試驗
　　體外培養(yǎng)雞腹腔巨噬細胞， MTT法測定不同濃度的融合蛋白ompA-Fc、omp

9、A及TPPPS對巨噬細胞的細胞毒性，以確定后續(xù)試驗最佳使用劑量。之后分別將特定濃度的ompA-Fc-TPPPS、ompA-Fc、ompA和PBS與腹腔巨噬細胞共培養(yǎng)，中性紅試驗檢測腹腔巨噬細胞胞飲活性，Griess法、ELISA試劑盒分別檢測腹腔巨噬細胞NO及TNF-α分泌能力，間接免疫熒光法檢測腹腔巨噬細胞對ompA吞噬能力，流式細胞儀檢測腹腔巨噬細胞分泌MHC-II分子的能力。結果表明，ompA-Fc、ompA蛋白及TPPPS對腹腔

10、巨噬細胞細胞毒性不明顯，并且TPPPS可劑量依賴性的增加細胞數(shù)量。同時，TPPPS也劑量依賴性的提高腹腔巨噬細胞胞飲、NO、TNF-α分泌能力。此外，連接的Fc及TPPPS佐劑也顯著提高了腹腔巨噬細胞對ompA吞噬活性及MHC-II分子的表達。以上研究表明，連接IgY Fc的融合蛋白可有效提高腹腔巨噬細胞的活性，而TPPPS為一種有效巨噬細胞激活劑。
　　3. TPPPS對融合蛋白的免疫增強效果的研究
　　將本實驗室經(jīng)水提醇

11、沉法提取的泰山松花粉多糖與經(jīng)畢赤酵母表達系統(tǒng)提取的融合蛋白ompA-Fc、ompA等體積混合配比制備相應疫苗，-80℃?zhèn)溆?。隨后對120只SPF雛雞隨機分成4組，之后分別在3、7、14 d后，對各組雛雞進行頸部皮下接種0.2 mL ompA-Fc-TPPPS、ompA-Fc、ompA亞單位疫苗和PBS。隨后在首免后的第7、14、21、28、35、42、49 d，對各實驗組隨機抽取3只雞進行心臟采血收集樣品，以檢測其血清抗體效價，白細胞介

12、素-2、白細胞介素-4（IL-2、IL-4），外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞含量及T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。同時在三免后的1周后，對各組隨機抽取的20只雞攻毒，進行動物保護試驗測定（除對照組），期間連續(xù)7d對各組雞群臨床癥狀及保護率進行觀察并記錄。試驗結果表明，單純的ompA-Fc亞單位疫苗可有效誘導機體產(chǎn)生抗ompA特異性抗體，分泌IL-2、IL-4，提高CD4+T、CD8+淋巴細胞百分含量和T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，同時提供了近80％的動物保護