黃芪多糖對(duì)尿路細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、目的：尿路感染(Urinary tract infection， UTI)是臨床常見的感染性疾病之一，女性較為多見。其已成為慢性腎功能不全的主要病因。然而，近年來由于抗生素耐藥的逐年增加，感染菌在尿路細(xì)胞內(nèi)的長期定居以及機(jī)體尿路免疫失衡等原因嚴(yán)重影響了單一抗生素治療的效果，臨床治療出現(xiàn)了困境，也增加了患者的身心痛苦。因此，尋找并開發(fā)抗生素以外的治療方案，是應(yīng)對(duì)UTI的新策略。
　　 尿路固有免疫是機(jī)體預(yù)防病原菌侵入的重要屏障，起

2、著抵抗微生物的防御作用。TLR4在尿路細(xì)胞固有性免疫中扮演重要角色，其在尿路主要表達(dá)于膀胱上皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞。TLR4與其配體結(jié)合后，可以通過MyD88依賴或cAMP/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，活化尿路細(xì)胞，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮抵抗細(xì)菌入侵，促進(jìn)細(xì)菌排出等固有性免疫作用。
　　 前期的臨床調(diào)查研究已發(fā)現(xiàn)中藥黃芪能夠通過上調(diào)慢性尿路感染患者TLR4的表達(dá)提高機(jī)體的免疫能力，提高治療效果。而黃芪是多種化學(xué)成分的混合物，黃芪

3、多糖(Astragalus polysaccharides， APS)作為黃芪的主要成分，也是TLR4的配體，其是否能夠通過TLR4調(diào)節(jié)尿路粘膜免疫功能的研究還鮮有報(bào)道。
　　 本研究旨在將黃芪多糖作用于膀胱上皮細(xì)胞株5637細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞株A498、人單核細(xì)胞型淋巴瘤THP-1細(xì)胞及小鼠后，探索黃芪多糖對(duì)尿路細(xì)胞TLR4表達(dá)、細(xì)胞因子的分泌、抗菌效應(yīng)、與LPS的競爭作用以及小鼠膀胱炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的影響，進(jìn)一步研究黃芪多糖調(diào)

4、節(jié)尿路粘膜免疫功能的機(jī)制，為尿路感染的免疫調(diào)節(jié)、治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.TLR4表達(dá)的檢測：將不同濃度的黃芪多糖及黃芪多糖與LPS的混合物分別與5637細(xì)胞、A498細(xì)胞、THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)；
　　 2.5637細(xì)胞的抗侵襲作用：不同濃度的黃芪多糖及黃芪多糖與LPS的混合物刺激5637細(xì)胞48小時(shí)后，加入大腸桿菌U30共培養(yǎng)1小時(shí)，徹底

5、洗去未侵入細(xì)胞的大腸桿菌，將侵入細(xì)菌的細(xì)胞用0.5％的TritonX-100溶解，溶解液稀釋后LB平板培養(yǎng)過夜，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；
　　 3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測細(xì)胞因子的表達(dá)：黃芪多糖作用于5637細(xì)胞、A498細(xì)胞、THP-1細(xì)胞，以及感染模型小鼠膀胱和腎組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR測定IL-6、IL-8、TNF-α、MyD88的mRNA表達(dá)。
　　 4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：8周齡Balb/C雌鼠隨機(jī)分為2組

6、，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組15只。大腸桿菌U30株經(jīng)LB液體培養(yǎng)基48小時(shí)靜置培養(yǎng)，生理鹽水洗滌，以每只108CFU/50μl的菌量，經(jīng)小鼠尿道注入膀胱。感染6小時(shí)后，對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水，100μl/只；實(shí)驗(yàn)組，腹腔注射黃芪多糖注射液，每只200mg/kg，每天一次，共注射3天。
　　 5.膀胱內(nèi)細(xì)菌的菌落計(jì)數(shù)：處死小鼠，將膀胱剪碎后用TritonX-100溶解，溶解液稀釋后涂布于固體LB平板培養(yǎng)基，37℃溫箱孵育過夜，進(jìn)行菌

7、落計(jì)數(shù)。
　　 6.制作感染小鼠膀胱、腎組織切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。
　　 結(jié)果：
　　 1.黃芪多糖作用于5637、A498和THP-1細(xì)胞48小時(shí)后，三種細(xì)胞表面TLR4表達(dá)均有顯著增加。不同濃度的APS作用于5637細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，均能刺激TLR4表達(dá)增加(P＜0.05)，但不同濃度間沒有顯著差異(p＞0.05)；黃芪多糖與LPS混合后，仍可刺激TLR4表達(dá)增加(P＜0.05)

8、，與APS單獨(dú)刺激相比有顯著差異(P＜0.05)，而與LPS單獨(dú)刺激相比無顯著差異(p＞0.05)。APS以100μg/ml的濃度作用A498和THP-1細(xì)胞48小時(shí)后，與對(duì)照組相比，也能顯著刺激兩種細(xì)胞TLR4表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。
　　 2.5637細(xì)胞抗侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：APS以20μg/ml、100μg/ml作用于5637細(xì)胞48小時(shí)后，U30細(xì)菌感染細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)侵入的細(xì)菌數(shù)分別為70.45±15.5，82.73±38.

9、25，顯著低于空白對(duì)照組234.9±115，(P＜0.05)，不同濃度的APS與2μg/ml LPS共同作用5637細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)也顯著低于對(duì)照組，且隨著APS濃度增高(20、100、500μg/ml)，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)呈下降趨勢。
　　 3.Real-time PCR檢測顯示，5637細(xì)胞經(jīng)100μg/ml的APS刺激后，IL-6和IL-8mRNA表達(dá)均明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.05); LPS與不同濃度的APS共同作用56

10、37細(xì)胞，與對(duì)照組相比，IL-6、IL-8mRNA表達(dá)也顯著降低(P＜0.05)，但不同APS濃度組間比較無顯著差異。A498細(xì)胞經(jīng)100μg/mlAPS刺激后，IL-6和IL-8mRNA表達(dá)量比空白對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，而THP-1細(xì)胞經(jīng)100μg/mlAPS刺激后，IL-6、TNF-α、MyD88與空白對(duì)照組相比，顯著升高(P＜0.05)。
　　 4.大腸桿菌感染小鼠，膀胱和腎臟經(jīng)Real-time PCR檢測，A

11、PS治療組IL-6mRNA的相對(duì)表達(dá)與空白對(duì)照組比較無明顯差異(P＞0.05)；而TNF-α表達(dá)量與空白對(duì)照組比較有所上升(P＜0.05)。
　　 5.小鼠膀胱內(nèi)感染的菌落計(jì)數(shù)顯示，注射APS的小鼠膀胱內(nèi)細(xì)菌數(shù)明顯低于生理鹽水對(duì)照組(P＜0.05)，其數(shù)值分別為APS組56.67±20.81，生理鹽水對(duì)照組140±52.92。
　　 6.感染小鼠膀胱組織經(jīng)HE染色顯示，注射APS組小鼠膀胱組織與對(duì)照組相比，炎細(xì)胞浸潤顯著

12、低于對(duì)照組膀胱，粘膜層較平滑、完整。
　　 結(jié)論：
　　 1.黃芪多糖能明顯促進(jìn)5637細(xì)胞、A498細(xì)胞和THP-1細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)，各濃度之間無顯著差別。
　　 2.黃芪多糖可顯著增強(qiáng)5637細(xì)胞抵抗U30侵襲的能力，且在LPS濃度不變的情況下，抗侵襲能力隨著APS濃度的提高而增加。
　　 3.黃芪多糖可明顯降低5637細(xì)胞和A498細(xì)胞IL-6、IL-8mRNA的表達(dá)。但可促進(jìn)THP-1細(xì)胞I