LC-MS-MS法和微生物法在評價地紅霉素生物等效性中的差異.pdf

1、地紅霉素是基于紅霉素結(jié)構(gòu)改造而產(chǎn)生的新一代14元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，系紅霉胺的前體藥物，目前研究地紅霉素生物等效性方法主要有兩種類型：分子濃度法和生物效應(yīng)法，前者適用于單一化學(xué)成分的體內(nèi)生物等效性研究，后者適用于多組分研究，且具有相似的生物效應(yīng)。由于研究對象的不同，兩種研究方法在評價藥物生物等效性中可能存在差異。LC-MS/MS（簡稱質(zhì)譜法）與微生物法為兩種類型的代表方法，本文采用質(zhì)譜法與微生物法兩種研究方法測定健康受試者單劑量口服地紅霉

2、素500mg后血藥濃度，分別研究地紅霉素生物等效性，并研究兩種方法在評價地紅霉素生物等效性中的是否存在差異。
　　 第一部分 LC-MS/MS測定人血漿中紅霉胺的分析方法
　　 目的：本試驗旨在建立LC-MS/MS法測定血漿中紅霉胺的濃度，研究地紅霉素的人體藥代動力學(xué)和生物等效性。
　　 方法：本試驗采用LC-MS/MS法測定血漿中紅霉胺的濃度。以Restek Allure C18（4.6×50mm，5.0μm）

3、色譜柱為分析柱，流動相為甲醇：0.5％甲酸水溶液（50：50，v/v），流速0.5mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫20℃。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，噴霧電壓為5500V，霧化溫度為550℃，霧化氣為30L/min，簾氣為20L/min，碰撞氣為12L/min；正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測，用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z735.7→m/z577.5（紅霉胺），m/z282.2→m/z212.2（酚妥拉明），碰撞誘導(dǎo)解離電壓分別為36V（紅霉胺

4、）和27V（酚妥拉明）；駐留時間為200ms。采用固相萃取進(jìn)行血樣處理。對方法特異性、線性和定量下限、精密度和準(zhǔn)確度、樣品穩(wěn)定性、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)等方面進(jìn)行方法學(xué)確證。
　　 結(jié)果：在本試驗建立的分析條件下，通過正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測，方法特異性更強(qiáng)，血漿中其它內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測定。在所選擇色譜、質(zhì)譜條件下，紅霉胺與內(nèi)標(biāo)分離效果良好，離子響應(yīng)穩(wěn)定且靈敏，保留時間合適，無明顯基質(zhì)效應(yīng)。本法的線性范圍為5.0-1000.0ng/m

5、L，相關(guān)系數(shù)在0.9977-0.9994之間，典型回歸方程為：v=1.18×100x-1.49×10-3r=0.9991（n=6）；定量下限為5.0ng/mL；本法測定低、中、高（10.0、100.0、800.0ng/mL）3個血漿樣品中紅霉胺的濃度，日內(nèi)RSD≤4.8％、日間RSD≤4.6％，RE≤7.6％；低、中、高紅霉胺血漿樣品的提取回收率分別為91.7％、96.3％和93.0％，內(nèi)標(biāo)血漿樣品的提取回收率為92.1％（n=9）；樣

6、品在避光條件下室溫放置4h，預(yù)處理后室溫放置24h，經(jīng)3次凍融循環(huán)及凍存60d的穩(wěn)定性良好，RSD均≤4.2％。
　　 結(jié)論：采用固相萃取技術(shù)處理血樣，LC-MS/MS法測定血漿中紅霉胺的濃度，完全可以滿足方法學(xué)要求，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可以準(zhǔn)確的測定人血漿樣品中的紅霉胺，可用于地紅霉素制劑的藥代動力學(xué)和生物等效性研究。
　　 第二部分 LC-MS/MS法研究地紅霉素腸溶片的生物等效性
　　 目的：研究

7、健康受試者口服地紅霉素腸溶片500mg后，其主要代謝物紅霉胺在人體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，并根據(jù)受試藥物和參比藥物的主要藥代動力學(xué)參數(shù)統(tǒng)計分析結(jié)果判定兩制劑是否具有生物等效性。
　　 方法：20名受試者隨機(jī)分為2組，按雙周期二交叉設(shè)計試驗，每組受試者前后兩次隨機(jī)空腹口服受試藥物和參比藥物，于間隔期后兩組互換，兩次試驗周期間隔時間為14日。分別在服藥前取空白血樣，于服藥后1.5，2，3，4，5，6，8，10，12，24，48，72，9

8、6h各個時刻采集14個血樣，試驗所得紅霉胺血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS2.0程序軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)，數(shù)據(jù)處理方法用逐個受試者的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)作曲線擬合，求得個體參數(shù)后計算平均值。采用DAS2.0統(tǒng)計軟件對各制劑所得的主要藥代動力學(xué)參數(shù)Cmax、AUC值進(jìn)行方差和生物等效性統(tǒng)計，Cmax和 Tmax為實測值，Cmax及AUC值經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后作雙單側(cè)t檢驗，Tmax用非參數(shù)法分析。
　　 結(jié)果：在測定樣品過程中，質(zhì)控樣品包含低、中、高

9、三個濃度（10.0、100.0、800.0ng/mL）共45個，超過總樣品的5％，且RE均小于15％，所有批次樣品測定結(jié)果符合方法學(xué)要求；采用AIC判斷法房室模型，權(quán)重系數(shù)取1/C2，取最小值，經(jīng)模擬各受試者血藥濃度數(shù)據(jù)，大部分受試者符合二房室模型方程，此模型下兩制劑部分參數(shù)如t1/2α、t1/2β、t1/2Ka等無明顯差異，表明兩制劑的藥物代謝過程基本相同；消除半衰期按t1/2=0.693/Zeta計算，藥時曲線下面積（AUC）由梯形

10、法求得，受試藥物和參比藥物主要藥代動力學(xué)參數(shù)分別為：34.6和33.1h（消除半衰期）、4.4和4.7h（Tmax）、249.2和265.9ng/mL（Cmax）、3063.0和3166.5ng/mL·h（AUC0-96h）、3480.6和3561.8ng/mL·h（AUC0-∞）；紅霉胺Cmax[1n]、AUC0-96h[1n]和AUC0-∞[1n]值多因素方差分析結(jié)果表明，個體間有顯著性差異（P<0.05），制劑間及周期間均無顯著性

11、差異（P>0.05），Cmax、AUC0-96h、AUC0-∞雙向單側(cè)t檢驗結(jié)果表明受試制劑Cmax的90％可信限落在參比制劑70％-143％之間，受試藥物AUC的90％可信限落在參比藥物80％-125％之間；經(jīng)檢驗受試藥物和參比藥物符合等效標(biāo)準(zhǔn)，具有生物等效性。
　　 結(jié)論：本試驗主要藥代動力學(xué)參數(shù)與參考文獻(xiàn)報道基本一致，通過20名健康受試者隨機(jī)單次口服受試藥物地紅霉素腸溶片（T）與參比藥物地紅霉素腸溶片（R）的交叉試驗，經(jīng)統(tǒng)

12、計分析證明兩藥物具有生物等效性。受試藥物相對于參比藥物的紅霉胺相對生物利用度為100.7±21.7％。LC-MS/MS測定方法在樣品測定過程中耐用性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可保證大批量生物樣品在短時間內(nèi)完成測定。
　　 第三部分微生物法研究地紅霉素生物等效性及其與LC-MS/MS法評價地紅霉素生物等效性中的差異
　　 目的：本試驗通過微生物法測定口服兩種地紅霉素制劑500mg后不同時間的血樣濃度，并與LC-MS/MS法測定結(jié)果

13、進(jìn)行比較，研究兩種測定方法在評價地紅霉素生物等效性方面是否存在差異。
　　 方法：以藤黃微球菌為檢定菌，采用抗生素Ⅱ號培養(yǎng)基（pH7.9±0.1）。對分析方法特異性、線性和定量下限、精密度和準(zhǔn)確度、樣品穩(wěn)定性等方面進(jìn)行方法學(xué)確證。20名健康受試者口服單劑量500mg受試藥物和參比藥物后，測定紅霉胺不同時間血藥濃度。試驗所得紅霉胺血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS2.0程序軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)，數(shù)據(jù)處理方法用逐個受試者的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)作曲

14、線擬合，求得個體參數(shù)后計算平均值。經(jīng)F檢驗判斷兩組結(jié)果是否具有方差齊性，對方差齊者采用組間t檢驗，判別質(zhì)譜法和微生物兩種方法測定結(jié)果之間是否具有顯著性差異。
　　 結(jié)果：空白血漿無明顯抑菌圈，空白血中其他成分不干擾微生物法的測定。線性范圍為15.0～500.0ng/mL，相關(guān)系數(shù)在0.9967-0.9985之間，典型回歸方程為：y=13.86541gC-6.0765，r=0.9978（n=6），定量下限為15.0ng/mL。本法

15、測定30.0、100.0、500.0ng/mL3個血漿樣品中紅霉胺的濃度，日內(nèi)RSD分別為8.0％、6.0％和4.8％，日間RSD分別為10.0％、11.2％和8.2％，方法回收率分別為110.5％、103.7％和106.6％，樣品凍存90d的穩(wěn)定性良好，RSD均不大于5.0％。T和R主要PK參數(shù)分別為：30.96和31.29h（t1/2）、4.4和4.7h（Tmax）、256.5和268.3ng/mL（Cmax）、3026.8和308

16、0.0ng/mL·h（AUC0-96h）、3669.3和3728.8ng/mL·h（AUC0-∞）。紅霉胺Cmax[1n]、AUC0-96h[1n]和AUC0-∞。[1n]值多因素方差分析結(jié)果表明，個體間有顯著性差異（P<0.05），制劑間及周期間均無顯著性差異（P>0.05），Cmax、AUC0-96h、AUC0-∞。雙向單側(cè)t檢驗結(jié)果表明受試制劑Cmax的90％可信限落在參比制劑70％-143％之間，受試藥物AUC的90％可信限落在

17、參比藥物80％-125％之間；經(jīng)檢驗受試藥物和參比藥物符合等效標(biāo)準(zhǔn)，具有生物等效性。兩種方法在評價地紅霉素生物等效性方面無明顯差異。
　　 結(jié)論：20名健康志愿者口服地紅霉素腸溶片500mg后，微生物法和質(zhì)譜法在評價地紅霉素生物等效性中無明顯差異，受試藥物相對于參比藥物的紅霉胺相對生物利用度為104.9±32.8％；地紅霉素在人體吸收過程中，微生物法測得的血藥濃度明顯高于質(zhì)譜法，主要原因是微生物法測定包括地紅霉素和紅霉胺兩者的總