OrexinA及其受體1干預鼠脂肪細胞PPAR-γ2及GLUT4mRNA表達和TG合成的分子機制研究.pdf

1、增食欲素(Orexin)是1998年發(fā)現的一類神經肽，包括orexinA和B。Orexin有二種受體亞型，均屬于G蛋白偶聯受體，Orexin1受體(OX1R)、Orexin2受體(OX2R)。其中OX1R是首先被發(fā)現的，且與orexin A有較高的親和性。大量的資料顯示，orexinA及其受體參與多種生理功能的調節(jié)，包括攝食、能量平衡、睡眠/覺醒、呼吸、學習與記憶、食物與藥物成癮、應激、胃腸道功能等。最近的研究表明，肥胖患者血中Orex

2、in A明顯低于正常人，并且與年齡、BMI呈負相關;還有研究顯示orexin過表達或應用藥理學誘導orexin受體表達可以阻止高脂飲食大鼠肥胖和胰島素抵抗的發(fā)展，這些研究提示orexinA與肥胖及胰島素抵抗密切相關。
　　肥胖是2型糖尿病主要的危險因素。脂肪組織不僅是體內主要的能量儲存器官，而且是重要的內分泌器官;不僅對機體的能量代謝平衡至關重要，還與胰島素抵抗、2型糖尿病的發(fā)生有密切關系。已有研究證實3T3-L1細胞（前脂肪細胞

3、）和脂肪細胞均存在orexin受體。并且有研究表明Orexin A可以提高脂肪細胞對葡萄糖的攝取率及阻止甘油的釋放;orexinA能夠激活人腎上腺細胞ERK1/2，JNK和p38 MAPK信號途徑。研究orexinA對脂肪細胞糖脂代謝功能的影響，對于研究肥胖和胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展的過程具有重要的意義。本課題擬通過高脂飲食誘導建立肥胖與胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)大鼠模型，檢測大鼠脂肪組織中OX1R的表達，以及o

4、rexinA對脂肪細胞PPAR-γ2表達的影響，并誘導3T3-L1細胞分化為分化的脂肪細胞后，研究orexinA對分化的脂肪細胞的GLUT4表達和脂質合成功能的影響及可能的分子機制，旨在探討orexinA在肥胖及IR中的相關作用及生物學機制。
　　實驗方法：
　　一、Orexin A及OX1R在高脂飲食誘導的肥胖相關胰島素抵抗大鼠表達中的研究
　　選擇4周齡SPF級雄性SD大鼠30只，隨機分為2組:正常對照組(NC組)

5、、高脂飲食組(HF組)。NC組予以普通顆粒飼料、HF組予以高脂飼料，飼養(yǎng)8周。8周后，各組大鼠稱取體重，每組隨機選取5只進行高胰島素-正常葡萄糖鉗夾實驗驗證胰島素抵抗大鼠模型的建立。其余大鼠心臟取血，分別進行血糖、血脂、胰島素、orexin A水平測定。處死大鼠后，摘取網膜及附睪周圍脂肪組織稱重，留取脂肪組織，應用western blot檢測脂肪組織OX1R蛋白表達。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析統(tǒng)計，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義

6、。
　　二、Orexin A及OX1R對脂肪細胞PPAR-γ2、GLUT4 mRNA表達和TG含量的影響
　　體外培養(yǎng)3T3-L1細胞，分別加入不同濃度的orexin A和/或OX1R特異性抑制劑(SB334867)進行干預，RT-PCR技術檢測PPAR-γ2 mRNA表達;分化3T3-L1細胞9天后，分別予以Orexin A10-7M、10-8M、10-9M以及OX1R抑制劑孵化細胞，RT-PCR技術檢測PPAR-γ2mR

7、NA和GLUT4 mRNA表達，甘油三酯試劑盒測定細胞內甘油三酯含量。
　　三、Orexin A及OX1R調節(jié)脂肪細胞內ERK、JNK、p38信號通路蛋白的研究
　　體外誘導分化的脂肪細胞，分別加入10-7M濃度的Orexin A和/或ERK、JNK、p38抑制劑及OX1R特異性抑制劑進行干預，western-blot檢測ERK、JNK、p38總蛋白及磷酸化蛋白的表達;RT-PCR檢測GLUT4 mRNA表達，甘油三酯試劑盒

8、測定細胞內甘油三酯含量。
　　實驗結果：
　　一、Orexin A及OX1R在高脂飲食誘導的肥胖相關胰島素抵抗大鼠中的表達
　　1、鉗夾技術及評價指標
　　實驗中高脂組大鼠體重、空腹血糖(FBG）、血胰島素(FIns)高于對照組;高脂組大鼠平均GIR60-120明顯低于對照組;而高脂組大鼠平均BG60-120高于對照組。
　　2、肥胖胰島素抵抗大鼠血清生化指標及血清胰島素的變化
　　高脂組大鼠血糖、血

9、胰島素、血甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平均高于對照組。
　　3、肥胖胰島素抵抗大鼠血orexin A及脂肪組織OX1R的變化
　　高脂組大鼠血Orexin A水平及脂肪組織的OX1R表達均低于對照組，并且OX1R水平與體脂含量、Lee's指數、TG、TC、血胰島素水平成負相關。
　　二、Orexin A及OX1R對脂肪細胞PPAR-γ2、GLUT4 mRNA表達和TG含量的影響
　　1、Orexin A對

10、3T3-L1細胞PPAR-γ2 mRNA表達的影響
　　不同濃度的Orexin A均可誘導3T3-L1細胞PPAR-γ2mRNA的表達，其中10-7M和10-8M組效應具統(tǒng)計學意義;并且PPAR-γ2mRNA表達受OX1R抑制劑抑制。
　　2、OrexinA對分化的脂肪細胞PPAR-γ2mRNA表達的影響
　　不同濃度的OrexinA均可誘導分化的脂肪細胞PPAR-γ2mRNA的表達，其中10-7M和10-8M組效應具

11、統(tǒng)計學意義;并且PPAR-γ2mRNA表達受OX1R抑制劑抑制。
　　3、Orexin A對分化的脂肪細胞GLUT4 mRNA表達及TG含量的影響
　　不同濃度的OrexinA可上調分化的脂肪細胞GLUT4mRNA表達及增加TG含量，其中10-7 M濃度時的orexinA刺激效應最顯著;加入OX1R特異性抑制劑后，orexinA對分化的脂肪細胞GLUT4mRNA的表達及TG合成受到抑制。
　　三、Orexin A及OX

12、1R調節(jié)脂肪細胞內ERK、JNK、p38信號通路蛋白的研究
　　1、Orexin A通過MAPK信號途徑(ERK1/2、JNK、P38)對分化的脂肪細胞GLUT4表達的影響
　　在培養(yǎng)液中加入JNK抑制劑、p38抑制劑分別可抑制10-7M濃度OrexinA誘導的JNK、p38磷酸化蛋白水平及GLUT4 mRNA的表達，當再加入OX1R抑制劑時這種抑制作用增強。加入ERK抑制劑(U0126)或/和OX1R抑制劑后，Orexin

13、A誘導的ERK磷酸化蛋白水平及GLUT4 mRNA的表達沒有明顯的抑制，無統(tǒng)計學意義。
　　2、Orexin A通過MAPK信號途徑(ERK1/2、JNK、P38)對分化的脂肪細胞TG合成的影響
　　在培養(yǎng)液中加入ERK抑制劑、JNK抑制劑、p38抑制劑或/和OX1R抑制劑分別可抑制10-7M濃度Orexin A誘導的ERK、JNK、p38磷酸化蛋白水平及TG含量。
　　結論：
　　1、高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠8周后

14、，可建立肥胖相關胰島素抵抗大鼠動物模型;肥胖相關胰島素抵抗大鼠血OrexinA水平降低;脂肪組織OX1R蛋白表達水平降低，表明orexinA及OX1R可能參與脂肪組織功能的調節(jié)。
　　2、Orexin A通過OX1R介導可上調3T3-L1細胞PPAR2 mRNA水平，并上調分化的3T3-L1細胞PPARγ2 mRNA水平，提示Orexin A可能在前脂肪細胞的分化中發(fā)揮一定作用。
　　3、OrexinA通過OX1R介導激活M