糖尿病小鼠肝臟中STAT1、PPAR-γ和HGF的表達(dá)及丹參素的干預(yù)作用.pdf

1、目的:氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)廣泛存在于糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中，隨著持續(xù)的高血糖，組織中自由基增加，炎性因子釋放，可導(dǎo)致肝、腎等重要臟器受損，引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥。阻斷這些刺激因子的作用，可預(yù)防和延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。以往有關(guān)糖尿病腎病的研究較多，近年來糖尿病所致肝損傷也引起了關(guān)注，加強(qiáng)對(duì)糖尿病器官損傷機(jī)制的研究有助于尋找新的治療途徑。
　　 丹參是臨床上治療糖尿病、心腦血管病等疾病的常用中藥，具有活血化瘀、改善微循環(huán)等作

2、用。丹參素為丹參的水溶性成分中的主要藥效成分之一，是一種酚性芳香酸類化合物。具有抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)、抗凝血及抑制血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心肌細(xì)胞、減輕腦缺血損傷等多種藥理作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，丹參素對(duì)肝臟也有保護(hù)作用。相關(guān)研究證實(shí)，丹參素不但可以明顯改善脂肪肝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用，提高對(duì)胰島素的反應(yīng)性，降低胰島素抵抗，而且能有效改善肝臟炎癥、減輕細(xì)胞外基質(zhì)沉積和膠原蛋白表達(dá)，具有抗肝纖維化作用，提示丹參素對(duì)糖尿病所致肝損傷

3、有一定防治作用，值得深入探討。
　　 本研究以鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生糖尿病，觀察糖尿病小鼠肝臟組織中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子1(STAT1)、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)以及肝細(xì)胞生長因子(HGF)的表達(dá)變化及丹參素對(duì)其表達(dá)的影響，探討丹參素對(duì)糖尿病小鼠肝臟保護(hù)作用的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.建立糖尿病小鼠模型及分組:
　　 健康C57BL

4、/6雄性小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C組，n=10），剩余小鼠一次性腹腔注射STZ200mg/kg（STZ500mg，加0.1mol/L檸檬酸溶液定容至50ml），72h后于小鼠尾尖取血，測(cè)定空腹血糖，選取血糖值大于20mmol/L者為糖尿病模型。正常對(duì)照組一次性腹腔注射等量0.1mol/L檸檬酸溶液。將篩選合格的糖尿病小鼠再隨機(jī)分為糖尿病模型組（M組）、低劑量丹參素組(D1組，15mg/kg)、中劑量丹參素組(D2組，30mg/kg)和

5、高劑量丹參素組(D3組，60mg/kg)，每組10只。丹參素各組小鼠灌胃給藥1次/天，正常組和糖尿病組小鼠灌胃給予同體積生理鹽水，連續(xù)給藥12周。末次給藥12小時(shí)后，小鼠眼內(nèi)眥靜脈取血，離心(1500g，15min)分離血清;摘取小鼠肝臟，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.空腹血糖、胰島素、糖基化血紅蛋白(GHb)檢測(cè):末次給藥12小時(shí)后運(yùn)用ACCU-CHEKActive試紙檢測(cè)小鼠空腹血糖;ELISA法測(cè)定血清胰島素和糖基化血紅蛋

6、白含量。
　　 3.肝臟功能檢測(cè):取小鼠血清，自動(dòng)生化分析儀AU-5400型檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。
　　 4.肝臟組織病理學(xué)檢測(cè):將小鼠肝臟常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，在顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。
　　 5.WesternBlot檢測(cè)小鼠肝臟STAT1、PPAR-γ、HGF蛋白的表達(dá):取凍存肝組織按蛋白裂解液說明書提取蛋白質(zhì)，按照WesternBlot測(cè)定方法操作，用Gelpr

7、o32軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化，以相應(yīng)蛋白條帶的IOD值/α-tubulin蛋白條帶的IOD值表示相對(duì)蛋白含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.空腹血糖、胰島素、糖基化血紅蛋白水平:與正常組相比，糖尿病模型組及丹參素組血糖及糖基化血紅蛋白水平均顯著增高（P＜0.01），而胰島素水平顯著降低（P＜0.01），高、中、低劑量丹參素對(duì)血糖、胰島素及糖基化血紅蛋白水平均無明顯影響。
　　 2.肝功能測(cè)定:與正常對(duì)照

8、組比較，糖尿病組小鼠血清AST、ALT顯著升高（P＜0.05）;與糖尿病組比較，丹參素組小鼠血清AST、ALT水平明顯下降（P＜0.05）;丹參素各劑量組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3.肝臟組織病理形態(tài)學(xué)改變:糖尿病模型組小鼠肝小葉界限不清，肝細(xì)胞脂肪變性，排列紊亂，未見明顯肝間質(zhì)纖維化。各劑量丹參素組小鼠肝小葉紊亂程度減輕，肝細(xì)胞排列基本規(guī)則，細(xì)胞脂肪變性明顯減少，但不同劑量組間無明顯差異。
　　 4.

9、丹參素對(duì)糖尿病小鼠肝臟組織中STAT1、PPAR-γ和HGF蛋白表達(dá)的影響:與正常組比較，糖尿病小鼠肝組織中STAT1表達(dá)明顯增加（P＜0.01），PPAR-γ和HGF的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）;而丹參素可明顯上調(diào)肝臟組織中PPAR-γ和HGF的表達(dá)，減少STAT1的表達(dá)，此作用隨著丹參素劑量的增加而逐步增強(qiáng)（P＜0.01），高劑量丹參素(60mg/kg)組STAT1的表達(dá)與正常組無明顯差異(P＞0.05）。
　　 5.相關(guān)

10、性分析結(jié)果:各組小鼠肝臟組織中PPAR-γ和HGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.934，P＜0.001），而STAT1與PPAR-γ和HGF的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.825和-0.910，P＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清AST、ALT較正常組顯著升高，肝臟亦出現(xiàn)一定病理形態(tài)學(xué)改變，表明長期血糖升高也可造成肝臟損傷。同時(shí)，小鼠肝臟組織中STAT1蛋白的表達(dá)明顯增加，提示JAK/STA

11、T1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與了糖尿病肝損害的發(fā)生和發(fā)展。
　　 2.丹參素雖不降低血糖，但可減輕糖尿病小鼠的肝臟損傷，改善肝臟功能，同時(shí)明顯升高肝臟中PPAR-γ蛋白和HGF蛋白的表達(dá)，而降低STAT1蛋白的表達(dá)，并呈一定劑量依賴性，提示丹參素對(duì)糖尿病性肝損傷的保護(hù)作用與上調(diào)PPAR-γ和HGF的表達(dá)，抑制STAT1的表達(dá)有關(guān)。
　　 3.糖尿病小鼠肝臟中STAT1的表達(dá)與PPAR-γ、HGF的表達(dá)之間呈明顯負(fù)相關(guān)，而PPA