丹參PPAR-α受體激動(dòng)效應(yīng)的體外研究.pdf

1、一、目的 構(gòu)建人PPAR-α受體的重組表達(dá)質(zhì)粒，基于PPAR-α受體的信號(hào)傳遞通路和利用雙螢光素酶報(bào)告基因分析方法，建立穩(wěn)定的PPAR-α激動(dòng)劑體外篩選體系，研究丹參不同組分及部分單一成分的PPAR-α激動(dòng)效應(yīng)，探討丹參抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)理。 二、方法 1.構(gòu)建重組質(zhì)粒1.1 PPAR-α蛋白表達(dá)質(zhì)粒從基因庫獲取人PPAR-α基因(GeneBank：NM_005036)蛋白編碼區(qū)全長序列(CDS：267..1

2、673)，依照引物設(shè)計(jì)原則及編碼序列上已有酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物并添加酶切位點(diǎn)；從正常肝組織細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得eDNA，PCR擴(kuò)增目的片段，克隆到pcDNA3.1真核表達(dá)載體，測序鑒定重組質(zhì)粒目的基因蛋白編碼區(qū)全長序列及開放閱讀框的正確性，命名為pcDNA-hPPAR-α。 1.2螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒合成PPRE反應(yīng)元件3倍重復(fù)序列5’-CAGGTCACTGGTCACAGGTCAG-3’，克隆到蟲螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3 prom

3、oter Vector多克隆位點(diǎn)，測序鑒定插入片斷序列的正確性，命名為pGL3-PPRE-luc。 2.丹參不同提取組分的制備取丹參原藥材粉末50g于1000mL燒瓶中加水500mL，超聲1hr，過濾，重復(fù)操作，合并兩次濾液，低溫負(fù)壓干燥，干燥產(chǎn)物懸于200mL80％甲醇中，過濾，濾渣為產(chǎn)物SMI，濾液低溫負(fù)壓干燥，得產(chǎn)物SM2：上步水提濾渣加甲醇500mL，超聲1hr，過濾，重復(fù)操作，合并兩次濾液，低溫負(fù)壓干燥，干燥產(chǎn)物懸于2

4、00mL乙酸乙酯中，過濾，濾渣為產(chǎn)物SM3，濾液低溫負(fù)壓干燥，得產(chǎn)物SM4。 3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因分析設(shè)丹參提取物組：SM1、SM2、SM3、SM4，單一成分組：丹參素、丹酚酸B、丹參酮、隱丹參酮，非諾貝特陽性對照組及空白對照組，pcDNA-hPPAR-α、pGL3-PPRE-luc及pRL-CMV載體共轉(zhuǎn)染297T細(xì)胞6小時(shí)后，各組加相應(yīng)試驗(yàn)溶液對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，試驗(yàn)液終濃度，提取物組為0.1、1、10、50μg/mL，單

5、一成分及非諾貝特組為0.1、1、10、50μM，常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)后測定螢光素強(qiáng)度，計(jì)算相對螢光素酶表達(dá)強(qiáng)度。 三、結(jié)果 1.重組質(zhì)粒的構(gòu)建核酸測序結(jié)果表明：所得pcDNA-hPPAR-α的蛋白編碼全長序列與基因庫一致，正向插入載體pcDNA3.1多克隆位點(diǎn)Nhe I和Kpn I之間，開放閱讀框正確。pGL3-PPRE-luc測序結(jié)果表明：插入的PPRE反應(yīng)元件片段序列正確，位置在Kpn I，Nhe I多克隆位點(diǎn)之間。

6、 2.丹參提取產(chǎn)物制得產(chǎn)物SM1、SM2、SM3、SM4、色澤均勻，產(chǎn)量分別為1.5、9.6、2.5、1.0g。 3.丹參組分的PPAR-α體外激動(dòng)效應(yīng)丹參素、丹酚酸B、丹參酮、隱丹參酮、SM1、SM2、SM3、SM4對報(bào)告基因的相對誘導(dǎo)率均小于1.06，與空白組比較無顯著差異，而濃度為0.1、1、10、50μM的非諾貝特陽性組相對誘導(dǎo)率分別為：0.82、1.29、1.72、1.94，表現(xiàn)有顯著差異。 四、結(jié)論

7、 成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-hPPAR-α和pGL3一PPRE-luc；非諾貝特陽性試驗(yàn)結(jié)果表明：成功建立基于PPAR-α信號(hào)通路及雙螢光素酶報(bào)告基因分析方法的PPAR-α激動(dòng)劑篩藥系統(tǒng)；經(jīng)篩藥體系的體外研究，四種丹參主要活性成分丹參素、丹酚酸B、丹參酮、隱丹參酮無顯著的體外PPAR-α激動(dòng)活性，在確保篩藥體系活性的給藥濃度下丹參四種不同提取組分無顯著的體外PPAR-α激動(dòng)作用；丹參中是否存PPAR-α激動(dòng)成分，其確切的抗動(dòng)脈粥樣硬