胰島素缺乏對(duì)阿爾茨海墨病轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)神經(jīng)病理改變的影響及機(jī)制研究.pdf

1、前言：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種發(fā)生于老年期或老年前期的慢性進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病,該疾病是以記憶力逐漸減退、認(rèn)知障礙為突出表現(xiàn),同時(shí)伴有精神行為異常、人格障礙等臨床癥狀。AD的主要病理特征是腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑(senile plaque,SP)和神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)。NFTs是神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白的過度磷酸化所致。老年斑的

2、核心成分是一種由39～43個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小神經(jīng)肽—Aβ(β-amyloidpeptide),Aβ是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)的裂解產(chǎn)物。腦內(nèi)APP代謝有兩條途徑,一條是非Aβ生成途徑,另一條是Aβ生成途徑。非Aβ生成途徑是α-分泌酶在α位點(diǎn)將APP水解成sAPPα和C83兩個(gè)片段,C83接著被γ-分泌酶生成P3片段,不形成Aβ;另一條途徑是APP被β-和γ-分泌酶連續(xù)裂解從而產(chǎn)生sA

3、PPβ和Aβ。
　　 胰島素是由胰島B細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)類激素,其主要功能是降低血糖。近年來的研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)存在胰島素和胰島素受體(insulin receptor,IR)。腦內(nèi)的胰島素可以由外周血中胰島素通過血腦屏障入腦,同時(shí)腦內(nèi)的部分神經(jīng)元也能夠合成和分泌胰島素。腦內(nèi)胰島素在血糖的調(diào)節(jié)、食物的攝入和體重的調(diào)節(jié)等過程中都發(fā)揮著重要的作用。胰島素可以通過胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響認(rèn)知功能。胰島素及胰島素信號(hào)通路調(diào)節(jié)的異常在AD發(fā)病和

4、進(jìn)展中起重要作用。流行病學(xué)資料顯示,與正常人群相比,AD患者腦脊液中胰島素水平明顯下降,并伴有腦內(nèi)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路障礙;伴有胰島素水平降低的AD患者更容易出現(xiàn)認(rèn)知功能異常。向AD轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)注射鏈脲佐菌素(streptozotozin,STZ),可影響腦內(nèi)胰島素受體功能,導(dǎo)致AD癥狀加重和漸進(jìn)性認(rèn)知功能損害,再向?qū)嶒?yàn)鼠腦內(nèi)注射胰島素后,動(dòng)物的認(rèn)知功能明顯恢復(fù)。采用經(jīng)鼻腔胰島素治療方法,能改善早期AD及遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙患者的認(rèn)知功

5、能。更有趣的是,一些臨床研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于糖尿病患者如果早期進(jìn)行胰島素治療,發(fā)展為AD的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)大大降低。另外,有研究發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的胰島素缺乏可以增高小鼠腦內(nèi)Aβ和磷酸化tau蛋白的表達(dá),表明胰島素缺乏參與Aβ的沉積和tau蛋白的異常磷酸化。但目前關(guān)于胰島素缺乏影響AD發(fā)病的機(jī)制研究尚不十分清楚。
　　 為了驗(yàn)證胰島素缺乏在AD發(fā)病中可能的作用及機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)選用APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠腹腔內(nèi)注射STZ,應(yīng)用行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子生

6、物學(xué)等手段,探討胰島素缺乏影響AD發(fā)病的證據(jù)及機(jī)制。同時(shí)采用過表達(dá)人APPsw基因的SH-SY5Y細(xì)胞,體外給予不同濃度的胰島素,觀察APP代謝和磷酸化tau蛋白的表達(dá),進(jìn)一步探討胰島素缺乏在AD發(fā)病中的作用。本項(xiàng)目的實(shí)施有望將胰島素通路作為預(yù)防和治療AD的新靶點(diǎn),為有效的延緩或阻抑Aβ沉積和tau蛋白異常磷酸化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、胰島素缺乏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)神經(jīng)病理改變和認(rèn)知功能影響及其

7、機(jī)制的研究采用3月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠,腹腔內(nèi)注射STZ,誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素缺乏的AD小鼠動(dòng)物模型。應(yīng)用Morris水迷宮檢測(cè)AD小鼠的行為學(xué)變化;應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)AD小鼠腦組織老年斑的分布;應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)AD小鼠腦內(nèi)APP mRNA的表達(dá);應(yīng)用ELISA對(duì)AD小鼠腦內(nèi)Aβ含量進(jìn)行定量分析;應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)AD小鼠腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化、APP代謝及胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　

8、 2、胰島素對(duì)高表達(dá)人APPsw的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)APP代謝及tau蛋白磷酸化的影響及其機(jī)制的研究采用高表達(dá)人APPsw的SH-SY5Y細(xì)胞,觀察胰島素對(duì)APP代謝的影響及機(jī)制研究。應(yīng)用Westem blotting技術(shù)檢測(cè)APPsw細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的磷酸化、APP代謝及胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)蛋白的表達(dá);應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)與共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)APPsw細(xì)胞內(nèi)p-GSK-3和Aβ及p-tau的共表達(dá)。
　　 結(jié)果：

9、>　　 一、胰島素缺乏對(duì)APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白磷酸化及認(rèn)知功能的影響
　　 1、胰島素缺乏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠體重、血糖和胰島素含量的影響與正常對(duì)照組AD小鼠相比,STZ誘導(dǎo)的胰島素缺乏導(dǎo)致AD小鼠血糖升高、體重下降及胰島素水平下降。
　　 2、胰島素缺乏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP裂解酶及其裂解產(chǎn)物蛋白表達(dá)的影響Western blotting結(jié)果顯示:STZ誘導(dǎo)的胰島素缺乏使AD小

10、鼠腦內(nèi)APP695蛋白水平明顯增高;STZ組BACE1、sAPPβ、CTFs蛋白表達(dá)明顯增多,而sAPPα表達(dá)下降。
　　 3、胰島素缺乏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ及老年斑的影響免疫組化和ELISA結(jié)果顯示:STZ誘導(dǎo)的胰島素缺乏使AD小鼠大腦皮層、海馬的老年斑塊的數(shù)量和體積明顯增多;STZ組Aβ1-42含量明顯增加。
　　 4、胰島素缺乏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化的影響免疫組化和Wester

11、n blotting結(jié)果顯示:STZ誘導(dǎo)的胰島素缺乏使AD小鼠腦內(nèi)Thr231和Ser396位點(diǎn)上的tau蛋白磷酸化表達(dá)水平增高。
　　 5、胰島素缺乏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響Morris水迷宮結(jié)果顯示:STZ誘導(dǎo)的胰島素缺乏使AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力均顯著降低。
　　 二、胰島素缺乏加劇APP/PS1小鼠腦內(nèi)神經(jīng)病理改變的分子生物學(xué)機(jī)制
　　 1、胰島素缺乏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因

12、小鼠腦內(nèi)胰島素受體(IR)磷酸化的影響Western blotting結(jié)果顯示:STZ誘導(dǎo)的胰島素缺乏使AD小鼠腦內(nèi)p-IR/IR比值明顯下降。
　　 2、胰島素缺乏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)GSK-3蛋白活性的影響Western blotting結(jié)果顯示:STZ誘導(dǎo)的胰島素缺乏使AD小鼠腦內(nèi)p-GSK-3α/GSK-3α和p-GSK-3β/GSK-3β的比值明顯下降。
　　 3、胰島素缺乏對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠

13、腦內(nèi)MAPK蛋白活性的影響Western blotting結(jié)果顯示:STZ誘導(dǎo)的胰島素缺乏使AD小鼠腦內(nèi)p-JNK1/JNK1和p-JNK2/JNK2的比值明顯增高,而p-ERK/ERK和p-P38/P38的比值沒有明顯變化。
　　 三、胰島素對(duì)轉(zhuǎn)染APPsw細(xì)胞內(nèi)APP代謝及tau蛋白磷酸化的影響
　　 1、胰島素對(duì)APPsw細(xì)胞內(nèi)GSK-3和JNK蛋白活性的影響Western blotting結(jié)果顯示:不同濃度胰島素

14、使APPsw細(xì)胞p-GSK-3α/GSK-3α和p-GSK-3β/GSK-3β的比值逐漸增高;而胰島素對(duì)P-JNK/JNK比值沒有明顯影響。
　　 2、胰島素對(duì)APPsw細(xì)胞內(nèi)APP裂解產(chǎn)物蛋白表達(dá)的影響Western blotting和免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示:100 nM和1000 nM的胰島素使APPsw細(xì)胞內(nèi)sAPPα蛋白表達(dá)明顯增多,CTFs蛋白表達(dá)下降。Ap和p-GSK-3主要分布于細(xì)胞質(zhì)中,而且在APPsw細(xì)胞中二者的

15、表達(dá)有一定關(guān)系。
　　 3、胰島素對(duì)APPsw細(xì)胞內(nèi)tau蛋白磷酸化的影響Western blotting結(jié)果顯示:1000 nM的胰島素使APPsw細(xì)胞內(nèi)Thr231和Ser396位點(diǎn)上的tau蛋白磷酸化表達(dá)水平降低。P-tau和p-GSK-3主要分布于細(xì)胞質(zhì)中,而且在APPsw細(xì)胞中二者的表達(dá)有一定關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1、STZ誘導(dǎo)的胰島素缺乏可加劇APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白異常