萊菔硫烷對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠神經(jīng)行為的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、前言
　　隨著世界人口老齡化的到來，老年癡呆患者數(shù)量持續(xù)上升，對(duì)人類健康的危害日益突出。阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是老年癡呆的主要類型之一，早期可導(dǎo)致病患智力低下、記憶喪失，晚期嚴(yán)重者可完全喪失生活自理能力，給家庭和社會(huì)增加了沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問題。面對(duì)目前嚴(yán)峻的AD發(fā)病形勢(shì)，深入探討AD的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的早期防治措施，已成為全世界學(xué)者的研究熱點(diǎn)。
　　AD的主要病理

2、表現(xiàn)為大腦皮質(zhì)彌漫性萎縮，溝回增寬，腦室擴(kuò)大，并可見到β淀粉樣蛋白（β-amyloidprotein，Aβ）沉積形成的老年斑(Senileplaques，SP)，膽堿能神經(jīng)元的大量丟失，以及細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化Tau蛋白所致的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(Neurofibrillarytangles，NFT)。由于AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前存在多種假說解釋其成因，其中Aβ級(jí)聯(lián)假說在眾多假說中占主導(dǎo)地位。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ的過度產(chǎn)生和聚集對(duì)神經(jīng)元具有毒性作用，可觸

3、發(fā)大腦神經(jīng)元功能失常、死亡，且與G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常密切相關(guān)。G蛋白由α、β、γ三種亞基構(gòu)成，其中α亞基變異最大，決定G蛋白的特異性。在AD患者腦內(nèi)，Gq/11α介導(dǎo)的磷酸肌醇水解途徑受累最為嚴(yán)重。長(zhǎng)久以來，Gβγ被認(rèn)為是無功能性亞基，但近年研究發(fā)現(xiàn)，Gβγ也在多方面發(fā)揮著重要作用，其中Gβ亞基通常在Gβγ復(fù)合物中起到特異性效應(yīng)調(diào)控的決定性作用。Gβ2作為Gβ亞基的一種，廣泛分布于腦內(nèi)，且可能與一些神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。大量

4、研究證實(shí)，Gq/11α被活化后，可通過增加磷脂酶C活性，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信使三磷酸肌醇，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的鈣釋放。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，Gβ亞基可以抑制電壓依賴性N和P/Q型鈣通道開放，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，維持細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平的升高可造成Aβ生成增多，且加速Aβ聚集。因此，調(diào)控G蛋白表達(dá)，防止細(xì)胞內(nèi)Ca2+紊亂，對(duì)減少AD腦內(nèi)Aβ的產(chǎn)生和沉積，有效延緩AD發(fā)生發(fā)展具有重要意義。
　　目前，植物化學(xué)物

5、因其為天然成分，對(duì)人體毒副作用較少并易于提取等優(yōu)點(diǎn)日益受到人們關(guān)注。植物化學(xué)物萊菔硫烷（Sulforaphane，SFN）是廣泛存在于十字花科蔬菜中的一種異硫氰酸鹽，在皮質(zhì)損傷大鼠和中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損傷模型中發(fā)現(xiàn)SFN具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，SFN可明顯減輕腦內(nèi)單次注射Aβ誘導(dǎo)的急性AD模型小鼠認(rèn)知功能障礙，然而其體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SFN對(duì)Aβ聚集并沒有抑制作用。關(guān)于SFN對(duì)AD患者/模型動(dòng)物神經(jīng)行為的影響及其作用機(jī)制

6、尚有待證實(shí)和探討。因此，本研究應(yīng)用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)與鋁聯(lián)合染毒誘導(dǎo)的AD模型小鼠，采用Morris水迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)探討SFN對(duì)AD模型小鼠神經(jīng)行為的影響，并通過觀察腦內(nèi)SP沉積情況、G蛋白水平以及細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平的變化揭示其作用機(jī)制。
　　材料與方法
　　一、動(dòng)物分組、處理及樣品采集
　　將初成年雄性小鼠按體重隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及干預(yù)組，每組10只。給藥途徑及劑量如下:模型組和

7、干預(yù)組小鼠飲用含鋁水(0.4g/100ml)并隔日皮下注射200mg/kgD-半乳糖，此外，干預(yù)組小鼠每日一次灌胃給予25mg/kgSFN，模型組小鼠每日一次灌胃等量蒸餾水，同時(shí)設(shè)立溶媒對(duì)照組。連續(xù)處理90d，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食及飲水。各組小鼠經(jīng)神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試后，乙醚麻醉，脫頸椎法處死，冰上迅速剝離腦組織。將每組10只小鼠左側(cè)大腦皮質(zhì)用于細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+和G蛋白mRNA水平的測(cè)定，右側(cè)腦組織以多聚甲醛固定，用于SP沉積情況的檢測(cè)。<

8、br>　　二、檢測(cè)指標(biāo)及方法
　?。ㄒ唬┮话銧顩r及體重
　　每日觀察各組小鼠的自主活動(dòng)、反應(yīng)性、毛須光澤及死亡情況等，并每周稱重一次觀察小鼠體重變化。
　?。ǘ┥窠?jīng)行為學(xué)
　　采用Morris水迷宮判斷小鼠學(xué)習(xí)記憶和空間定向及認(rèn)知功能;以曠場(chǎng)試驗(yàn)觀察小鼠適應(yīng)新環(huán)境的空間認(rèn)知與自主探索能力以及精神緊張度
　　（三）腦組織SP沉積
　　采用剛果紅染色法檢測(cè)各組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬SP沉積情況。
　　

9、（四）大腦皮質(zhì)Gq/11α、Gβ2mRNA水平
　　總RNA提取試劑盒提取大腦皮質(zhì)總RNA，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用SYBRGreenⅠ嵌合染料法對(duì)目的基因進(jìn)行Real-timeRT-PCR，分析Gq/11α、Gβ2mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。
　?。ㄎ澹┐竽X皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平
　　新型熒光探針Fluo-3/AM負(fù)載小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，每份樣品測(cè)定2萬個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)

10、度值，分析細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平。
　　三、統(tǒng)計(jì)分析
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以(X)±S表示。數(shù)據(jù)均滿足方差齊性，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。
　　結(jié)果
　　一、一般狀況及體重
　　整個(gè)受試期間各組小鼠活動(dòng)自如，狀態(tài)良好，未見異常表現(xiàn)及死亡。各組小鼠體重在受試期間均有所增加，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，各組小鼠體重之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義(P＞0.05)。
　　二、神經(jīng)行為學(xué)
　　水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組小鼠比較，干預(yù)組小鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠比較，模型組小鼠跨格和直立次數(shù)減少，中央格停留時(shí)間延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組小鼠比

12、較，干預(yù)組小鼠跨格和直立次數(shù)增加，中央格停留時(shí)間減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　三、腦組織SP沉積
　　與對(duì)照組比較，模型組小鼠大腦皮質(zhì)及海馬SP沉積數(shù)量均增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。干預(yù)組小鼠大腦皮質(zhì)及海馬SP沉積數(shù)量均少于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　四、大腦皮質(zhì)Gq/11α、Gβ2mRNA水平
　　與對(duì)照組比較，模型組小鼠大腦皮質(zhì)Gβ2mRNA水平降低，差異有統(tǒng)

13、計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。干預(yù)組小鼠大腦皮質(zhì)Gβ2mRNA水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組小鼠大腦皮質(zhì)Gq/11αmRNA水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　五、大腦皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平
　　與對(duì)照組相比，模型組小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，干預(yù)組小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。