萊菔硫烷對阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織Aβ沉積的干預(yù)研究.pdf

1、前言
　　阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是老年癡呆的主要類型，發(fā)生于老年前期及老年期，表現(xiàn)為一種持續(xù)性高級神經(jīng)功能活動障礙，定向力改變、記憶力減退、智力下降等，最終導(dǎo)致生活自理能力完全喪失。隨著全球人口老齡化進(jìn)程加快，AD等神經(jīng)退行性疾病在老年人中的發(fā)病率居高不下，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。
　　AD的發(fā)病與機(jī)體衰老、遺傳因素及某些環(huán)境危險(xiǎn)因素等有關(guān)，其大體病理改變以腦萎縮為主，表現(xiàn)為腦回變窄、

2、腦溝增寬、腦室變大，鏡下病理改變多見于老年斑(Senileplaques，SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillarytangles，NFT)、神經(jīng)元減少等。目前關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制存在多種假說，其中β-淀粉樣蛋白(Betaamyloidprotein，Aβ)級聯(lián)假說在AD形成的各種機(jī)制中占主導(dǎo)地位，該假說認(rèn)為，Aβ沉積是AD發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，也可能是各種因素導(dǎo)致AD的共同途徑。Aβ產(chǎn)生和清除平衡的破壞是其在腦內(nèi)沉積的主要原

3、因，因此，減少Aβ生成及增加Aβ從腦內(nèi)的清除可有效延緩AD的發(fā)生發(fā)展。淀粉樣前體蛋白β位分解酶1（Beta-siteAPP-cleavingenzyme-1，BACE1）是腦內(nèi)最主要的β-分泌酶，其裂解β-淀粉樣前體蛋白（Beta-amyloidprecursorprotein，APP）最終生成Aβ;而胰島素降解酶(Insulin-degradingenzyme，IDE)主要在腦部神經(jīng)元表達(dá)，參與降解可溶性的Aβ，其降解產(chǎn)物不再聚集和沉

4、積，也不具有神經(jīng)毒性。可見，BACE1和IDE是參與腦內(nèi)Aβ的生成和清除的關(guān)鍵酶。
　　目前尚無針對AD的特效藥物，故AD的早期預(yù)防至關(guān)重要。植物化學(xué)物在防治AD的研究中日益受到關(guān)注，萊菔硫烷(Sulforaphane，SFN)是一種異硫氰酸鹽，廣泛存在于西蘭花、卷心菜等十字花科蔬菜中。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損傷模型的研究中發(fā)現(xiàn)，SFN具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。最新研究報(bào)道，SFN可明顯改善經(jīng)腦內(nèi)單次注射Aβ的AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能

5、力和認(rèn)知功能，然而其體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)SFN對Aβ聚集有抑制作用。因此，關(guān)于SFN對AD的干預(yù)作用及其機(jī)制尚有待證實(shí)和探討。
　　本研究采用鋁和D-半乳糖(D-galactose，D-gal)聯(lián)合染毒制備AD模型小鼠，通過檢測血鋁水平確定受試小鼠鋁的內(nèi)暴露量，采用跳臺試驗(yàn)分析SFN對AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并從腦組織Aβ沉積情況及Aβ代謝相關(guān)酶BACE1、IDEmRNA表達(dá)水平角度初步探討其可能的作用機(jī)制，為尋找防治AD

6、的有效措施提供理論依據(jù)。
　　材料與方法
　　一、動物分組、處理及樣品采集
　　健康成年C57BL/6J小鼠30只，雌雄各半，體重范圍:18-22g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后按體重隨機(jī)分為對照組、模型組及干預(yù)組，每組10只。給藥途徑及劑量如下:模型組和干預(yù)組小鼠飲用含鋁水(0.4g/100ml)并隔日皮下注射200mg/kgD-gal，此外，干預(yù)組小鼠每日一次灌胃給予25mg/kgSFN，模型組小鼠每日一次灌胃等量蒸餾水，同時(shí)

7、設(shè)立溶媒對照組，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食及飲水。于處理第80d開始進(jìn)行為期2d的神經(jīng)行為學(xué)測試，并于處理后第90d，乙醚麻醉小鼠，摘眼球取血，離心，取上清供血鋁水平測定;剝離右側(cè)大腦皮質(zhì)用于測定BACE1和IDEmRNA表達(dá)水平;將左側(cè)半腦放入多聚甲醛固定液中固定，石蠟包埋后行冠狀位連續(xù)切片，用于分析腦組織Aβ沉積情況。
　　二、檢測指標(biāo)及方法
　?。ㄒ唬?、一般狀況觀察、體重、腦重及腦系數(shù)
　　每日一次觀察各組小鼠一般狀況

8、，并每周稱重一次觀察體重變化。小鼠處死后取腦并稱重，按下列公式計(jì)算腦系數(shù):腦系數(shù)(mg/g)=腦重(mg)/體重(g)。
　?。ǘ?、血鋁水平
　　利用石墨爐原子吸收分光光度法檢測各組小鼠血鋁水平。
　?。ㄈ?、學(xué)習(xí)記憶能力
　　采用跳臺試驗(yàn)分析各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　（四）、腦組織Aβ沉積
　　應(yīng)用免疫組化法檢測各組小鼠大腦皮質(zhì)及海馬Aβ沉積情況。
　　（五）、大腦皮質(zhì)BACE1、IDE

9、mRNA表達(dá)水平
　　用RNeasy離心柱試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再采用SYBRGreenⅠ嵌合染料法對目的基因進(jìn)行Real-timePCR擴(kuò)增反應(yīng)，以β-actin作為內(nèi)參，分析BACE1、IDEmRNA的相對表達(dá)水平。
　　三、統(tǒng)計(jì)分析
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用(x)±s表示，進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。滿足方差齊性時(shí)，兩兩比較采用LSD

10、;不滿足方差齊性時(shí)，兩兩比較采用Dunnett'sT3法;不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用中位數(shù)(M)和四分位間距(Q)表示，進(jìn)行多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。
　　結(jié)果
　　一、一般狀況觀察、體重、腦重及腦系數(shù)
　　整個(gè)受試期間各組小鼠活動自如，狀態(tài)良好，未見異常表現(xiàn)及死亡。各組小鼠的體重、腦重及腦系數(shù)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　二、血鋁水平
　　模型組和干預(yù)組小鼠

11、血鋁水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P＜0.01和P＜0.05）。干預(yù)組小鼠血鋁水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　三、學(xué)習(xí)記憶能力
　　跳臺試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠反應(yīng)期延長，潛伏期縮短，學(xué)習(xí)和記憶成績的錯(cuò)誤次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05);與模型組相比，干預(yù)組小鼠反應(yīng)期期縮短，潛伏期延長，學(xué)習(xí)和記憶成績的錯(cuò)誤次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或

12、P＜0.05)。干預(yù)組小鼠反應(yīng)期、潛伏期、學(xué)習(xí)和記憶的錯(cuò)誤次數(shù)與對照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　四、腦組織Aβ沉積
　　與對照組相比，模型組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬Aβ斑塊數(shù)量增多，而干預(yù)組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬Aβ斑塊少于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。干預(yù)組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬Aβ斑塊數(shù)量與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　五、大腦皮質(zhì)BACE1、IDEmRNA表達(dá)水平