六味地黃活性部位對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:阿爾茨海默病(AD)是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是腦中β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失。目前臨床上并無(wú)理想的治療AD的藥物。六味地黃湯(LW)是中醫(yī)滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典代表名方，臨床和藥理學(xué)研究表明，LW具有防治AD的作用。六味地黃苷糖(LW-AFC)是來(lái)源于LW的中藥五類(lèi)新藥，由LWD-b（糖苷部位）、LWB-B（多糖部位）和CA-30（寡糖部位）三個(gè)活性部位組成。本室前期研究結(jié)果表明，LW

2、-AFC能夠通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)(NIM)網(wǎng)絡(luò)平衡來(lái)改善AD模型小鼠的認(rèn)知功能。為進(jìn)一步明確LW中發(fā)揮上述藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用原理，本研究研究了組成LW-AFC的三個(gè)活性部位及其中的部分活性成分對(duì)AD模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的作用及可能的作用環(huán)節(jié)或機(jī)制，并與LW原方(LW)及LW活性部位復(fù)方（LW-AFC）進(jìn)行了比較。
　　研究方法:選擇快速老化小鼠(SAMP8)作為散發(fā)型AD(SAD)模型小鼠，選擇PrP-hAβPPswe

3、/PS1dE9(APP/PS1)轉(zhuǎn)基因小鼠作為家族型AD(FAD)模型小鼠，分別灌胃給予三個(gè)活性部位(LWD-b、LWB-B或CA-30)，并設(shè)置LW、LW-AFC、美金剛及多奈哌齊組作為具有不同作用機(jī)制的藥物對(duì)照組。分別灌胃給予7月齡SAMP8小鼠LW、LW-AFC、LWD-b、LWB-B或CA-30三個(gè)月，灌胃給予10月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠LW、LW-AFC、CA-30(0.48、0.96、1.92g/kg)或水蘇糖(STA)

4、三個(gè)月，通過(guò)老化度評(píng)分以及筑巢實(shí)驗(yàn)觀察它們對(duì)動(dòng)物老化狀態(tài)的影響;通過(guò)腦體比考察對(duì)腦萎縮程度的影響;通過(guò)自主活動(dòng)性、新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和穿梭箱實(shí)驗(yàn)，考察對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力等行為學(xué)的影響;采用AlphaLISA技術(shù)，檢測(cè)對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬及外周血中Aβ1-42含量的影響。為探討LW活性部位及活性成分的作用環(huán)節(jié)或機(jī)制，采用放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)對(duì)模型小鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）和下丘腦-垂體-性腺

5、軸（HPG）中相關(guān)激素水平的影響;并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾和外周血淋巴細(xì)胞亞型、采用液相蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子的含量。
　　研究結(jié)果:
　　第一章六昧地黃活性部位對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的作用研究
　　一、LW活性部位對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用研究
　　與SAMR1比較，SAMP8小鼠老化評(píng)分略有增高、腦重/體重比值及海馬/體重比值明顯下降，自主活動(dòng)能力、筑巢能力和主動(dòng)回避反應(yīng)能力不同程度降低。三個(gè)活性部位中

6、，除LWD-b外，LWB-B和CA-30均對(duì)上述指標(biāo)的變化具有不同程度地改善作用，其中，CA-30對(duì)SAMP8小鼠的老化度、筑巢能力、自主活動(dòng)性、主動(dòng)回避反應(yīng)能力和空間學(xué)習(xí)記憶能力有明顯改善作用，LWB-B對(duì)腦萎縮、自主活動(dòng)性和主動(dòng)回避反應(yīng)能力具有明顯改善作用。對(duì)照藥LW和LW-AFC可顯著降低SAMP8小鼠老化度、改善腦萎縮及提高筑巢能力，而美金剛和多奈哌齊除可提高SAMP8小鼠的自主活動(dòng)度和主動(dòng)回避反應(yīng)能力外，對(duì)其它老化相關(guān)指標(biāo)及學(xué)

7、習(xí)記憶相關(guān)指標(biāo)均無(wú)明顯改善作用。以上研究結(jié)果表明，CA-30部位在LW三個(gè)活性部位中對(duì)SAMP8老化及學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用最為突出，值得進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。
　　二、CA-30及其活性成分STA對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用研究
　　選用APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，深入研究了CA-30改善學(xué)習(xí)記憶能力的量效關(guān)系，并與組成CA-30的主要活性成分STA(0.45 g/kg)的作用進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，與野生型小鼠

8、相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠筑巢能力、短期物體記憶能力、主動(dòng)回避反應(yīng)能力和空間學(xué)習(xí)記憶能力均明顯降低。三個(gè)劑量的CA-30（0.48，0.96和1.92g/kg）以及STA對(duì)上述指標(biāo)的改變具有不同程度的改善作用，但未表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，CA-30的主要活性成分STA在0.45 g/kg劑量時(shí)對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用強(qiáng)度與中劑量CA-30(0.96g/kg)相當(dāng)。
　　綜合上述結(jié)果可以看出，在LW活性部位中，

9、LWB-B、CA-30及活性成分STA能不同程度地改善SAMP8小鼠或APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的老化狀態(tài)及學(xué)習(xí)記憶能力，但CA-30可能是LW發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶能力作用的主要藥效組分，LWB-B與CA-30發(fā)揮作用的側(cè)重不同，可能起輔助作用，LW對(duì)AD模型小鼠老化程度和學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用可能主要是CA-30和LWB-B共同作用的結(jié)果。
　　第二章六味地黃活性部位改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制研究
　　一、LW活性部位對(duì)NIM網(wǎng)

10、絡(luò)的調(diào)節(jié)作用研究
　　大量研究表明，SAMP8小鼠隨增齡表現(xiàn)為加速老化和學(xué)習(xí)記憶功能障礙，同時(shí)伴隨著NIM網(wǎng)絡(luò)的功能發(fā)生紊亂。本研究顯示，與對(duì)照相比，SAMP8小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌發(fā)生異常，下丘腦中CRH和GnRH、垂體中LH和TSH水平顯著增高;外周血T細(xì)胞亞群中以CD3e+CD8a+為標(biāo)記的抑制性T細(xì)胞(Ts)、CD3e+CD25+為標(biāo)記的活化T細(xì)胞、CD4+CD25+為標(biāo)記的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和以F4/80+為標(biāo)記的單核/巨噬細(xì)胞、以G

11、r1+為標(biāo)的中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，并且輔助性T細(xì)胞與抑制性T細(xì)胞的比值(Th/Ts=CD4+/CD8a+)降低，CD19+標(biāo)記的B細(xì)胞數(shù)量顯著減少，同時(shí)，促炎細(xì)胞因子TNFβ水平顯著增高，抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-5水平顯著降低，提示SAMP8小鼠免疫功能低下。LWD-b、LWB-B和CA-30對(duì)上述指標(biāo)的變化具有不同程度的改善作用，其中，三者對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)的恢復(fù)作用基本相同，但對(duì)免疫功能相關(guān)指標(biāo)的改善存在較大差異，主要表現(xiàn)為CA

12、-30除可改善外周血中T細(xì)胞亞群比例和B細(xì)胞數(shù)量外，同時(shí)也能糾正抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-5水平的降低，從而改善SAMP8免疫功能底下的狀態(tài);LWD-b主要改善外周血中T細(xì)胞亞群CD3e+CD8a+、CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)量，對(duì)抗炎細(xì)胞因子和炎性細(xì)胞因子均具有明顯改善作用;而LWB-B僅對(duì)外周血中炎性細(xì)胞因子的異常具有改善作用。
　　上述結(jié)果表明，LW活性部位LWD-b、LWB-B、CA-30對(duì)SAMP8小鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)激

13、素、免疫活性細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的異常均具有不同程度的改善作用，但三者作用的強(qiáng)度或側(cè)重有所不同，其中，CA-30的作用較為廣泛，可能是發(fā)揮NIM調(diào)節(jié)作用的主要部位，LWD-b及LWB-B調(diào)節(jié)免疫功能的作用較為局限，可能起著輔助或補(bǔ)充作用。LW三個(gè)活性部位LWD-b、LWB-B、CA-30對(duì)NIM的共同作用可能是LW改善AD學(xué)習(xí)記憶功能障礙的重要機(jī)制之一。
　　二、CA-30及其活性成分STA對(duì)免疫功能的作用研究
　　對(duì)CA-3

14、0調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠免疫功能的研究結(jié)果表明，與野生型小鼠比較，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠免疫功能發(fā)生紊亂，表現(xiàn)為在脾臟中以CD3e+標(biāo)記的T細(xì)胞數(shù)量減少，主要為以CD3e+CD4+標(biāo)記的輔助T細(xì)胞、以CD3e+CD8a+標(biāo)記的抑制性T細(xì)胞、以CD4+CD25+標(biāo)記的調(diào)節(jié)T細(xì)胞數(shù)量顯著減少。同時(shí)，以CD19+標(biāo)記的B細(xì)胞數(shù)量也顯著減少，而以F4/80+標(biāo)記的單核/巨噬細(xì)胞、以Gr1+標(biāo)記的中性粒細(xì)胞和CD4+/CD8a+比值均顯著

15、增加。在外周血中以CD3e+標(biāo)記的總的T細(xì)胞、以CD3e+CD4+標(biāo)記的輔助T細(xì)胞、以CD3e+CD25+為標(biāo)記的活化T細(xì)胞和以CD4+CD25+標(biāo)記的調(diào)節(jié)T細(xì)胞數(shù)量減少，而以F4/80+標(biāo)記的單核/巨噬細(xì)胞顯著增加。三個(gè)劑量的CA-30對(duì)上述免疫功能相關(guān)指標(biāo)均有不同程度的調(diào)節(jié)作用，但無(wú)明顯的量效關(guān)系，且不同劑量下的調(diào)節(jié)范圍各有側(cè)重，對(duì)于CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)量的減少，中劑量CA-30(0.96/kg)作用顯著，對(duì)于CD4+/CD8a

16、+比值的升高，小劑量(0.48/kg)作用明顯。STA的作用與CA-30類(lèi)似，提示其是CA-30中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要活性成分。與LW及LW-AFC的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，CA-30的作用基本與LW相似。
　　綜合以上結(jié)果可以看出，三個(gè)活性部位(LWD-b、LWB-B和CA-30)能不同程度地調(diào)節(jié)SAMP8小鼠或APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠所表現(xiàn)的NIM網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào)，三個(gè)活性部位對(duì)于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用類(lèi)似，但對(duì)免疫系統(tǒng)的作用各

17、有側(cè)重，其中CA-30的作用較為全面，而LWD-b對(duì)炎性及抗炎細(xì)胞因子、LWB-B僅對(duì)炎性細(xì)胞因子的異常有調(diào)節(jié)作用。上述結(jié)果提示，三個(gè)活性部位中CA-30是發(fā)揮調(diào)節(jié)NIM網(wǎng)絡(luò)作用的主要活性部位，LWD-b和LWB-B起輔助或補(bǔ)充調(diào)節(jié)作用，三者共同作用可能是LW調(diào)節(jié)NIM網(wǎng)絡(luò)平衡，發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶能力的可能機(jī)制。
　　研究結(jié)論:
　　1.LW三個(gè)活性部位中，CA-30和LWB-B能夠不同程度地改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其

18、中，CA-30的作用廣泛，可顯著降低老化度，改善筑巢能力、主動(dòng)回避反應(yīng)能力、物體識(shí)別記憶能力、空間學(xué)習(xí)記憶能力，可能是LW發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶功能作用的主要藥效組分，LWB-B和LWD-b對(duì)CA-30具有輔助或補(bǔ)充作用，三者協(xié)作發(fā)揮改善AD模型小鼠老化程度和學(xué)習(xí)記憶功能的作用。
　　2.LW三個(gè)活性部位LWD-b、LWB-B和CA-30能夠不同程度地調(diào)節(jié)SAMP8小鼠或APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠所表現(xiàn)的NIM網(wǎng)絡(luò)失衡，CA-30可能為其