萊菔硫烷對阿爾茨海默病的干預(yù)作用及其機制研究.pdf

1、目的:
　　本研究采用APPswe/PS1 dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠，觀察SFN是否可改善其認知功能障礙和腦組織病理學變化，以及突觸標志物—突觸后密度蛋白95(PSD95)的表達情況，并觀察SFN是否可改變該模型小鼠腦組織的Ace-H3K9、Ace-H4K12水平、NGF及其受體TRKA、P75NTR表達水平和自噬水平;此外，以Aβ25-35處理的SH-SY5Y細胞作為AD模型細胞，分析SFN對該模型細胞Ace-H3K9、Ace

2、-H4K12水平以及HDAC2、TRKA、P75NTR表達水平變化的時相分布。以此探討SFN對AD的干預(yù)作用及其機制，為AD的預(yù)防及早期干預(yù)提供科學依據(jù)。
　　實驗方法：
　　1、APPswe/PS1 dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠鑒定
　　雄性小鼠雜合體種鼠由美國Jackson實驗室引進，健康3月齡雌性C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心，雌鼠與雄鼠2∶1交配，提取子代小鼠基因組DNA，針對人APPswe、PS

3、1dE9基因及小鼠內(nèi)參基因合成特異性引物，經(jīng)PCR擴增后電泳，觀察電泳條帶，確定小鼠基因型。
　　2、動物分組、處理及取材
　　將20只4月齡APPswe/PS1 dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠按窩別和體重隨機分為AD模型組和AD模型干預(yù)組，同時設(shè)立野生型小鼠對照組和野生型小鼠干預(yù)組，并做相應(yīng)處理。
　　3、通過細胞培養(yǎng)、處理及樣品采集，對小鼠進行神經(jīng)行為學檢測及小鼠海馬相關(guān)蛋白的檢測、小鼠腦皮質(zhì)及SH-SY5Y細胞相關(guān)m

4、RNA轉(zhuǎn)錄水平檢測、小鼠腦皮質(zhì)及SH-SY5Y細胞相關(guān)蛋白檢測分析、小鼠腦組織自噬小泡的檢測等。并進行統(tǒng)計學處理
　　結(jié)果
　　1、小鼠一般狀況
　　受試期間各組小鼠未見異常表現(xiàn)及死亡。各組小鼠體重均有所增加，差異無統(tǒng)計學意義。
　　2、SFN改善AD模型小鼠神經(jīng)行為學能力
　　(1)曠場試驗
　　與野生對照及野生干預(yù)組相比，AD模型組小鼠穿格次數(shù)和抬頭次數(shù)減少，潛伏期延長，差異均有統(tǒng)計學意義;與AD

5、模型組比較，AD模型干預(yù)組小鼠穿格次數(shù)和抬頭次數(shù)增加，潛伏期減短，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　(2)跳臺試驗
　　與野生對照及野生干預(yù)組相比，AD模型組小鼠反應(yīng)期延長，潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計學意義;與AD模型組相比，AD模型干預(yù)組小鼠反應(yīng)期縮短，潛伏期延長，錯誤次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　(3) Morris水迷宮
　　與野生對照及野生干預(yù)組相比，AD模型組小鼠逃避潛伏期延長;與AD模型組相

6、比，AD模型干預(yù)組小鼠逃避潛伏期縮短。AD模型組小鼠穿越平臺次數(shù)少于野生對照及野生干預(yù)組;與AD模型組小鼠比較，AD模型干預(yù)組小鼠穿越平臺次數(shù)增多。
　　3、SFN改善AD模型小鼠腦組織病理學改變
　　(1) ChAT免疫陽性細胞數(shù)
　　AD模型組小鼠腦皮質(zhì)及海馬CA1、CA3、DG區(qū)ChAT免疫陽性細胞數(shù)明顯少于野生對照及野生干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計學意義;AD模型干預(yù)組小鼠腦皮質(zhì)及海馬CA1、CA3、DG區(qū)ChAT免疫

7、陽性細胞數(shù)均多于AD模型組，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　(2) Psd95 mRNA及其蛋白表達水平
　　AD模型組海馬CA1、CA3、DG區(qū)PSD95免疫陽性顆粒積分光密度值、腦皮質(zhì)Psd95 mRNA及其蛋白水平明顯低于野生對照及野生干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計學意義;AD模型干預(yù)組小鼠海馬CA1、DG區(qū)PSD95免疫陽性顆粒積分光密度值、腦皮質(zhì)Psd95 mRNA及其蛋白水平明顯高于AD模型組，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　(

8、3) Aβ斑塊數(shù)
　　與野生對照及野生干預(yù)組相比，AD模型組小鼠腦皮質(zhì)及海馬Aβ斑塊數(shù)量明顯增多，差異均有統(tǒng)計學意義，AD模型干預(yù)組小鼠腦皮質(zhì)及海馬CA1、CA2區(qū)Aβ斑塊少于AD模型組，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　4、SFN上調(diào)AD模型小鼠腦組織TRKA、P75NTR表達水平
　　AD模型組小鼠腦皮質(zhì)Trka、P75ntr mRNA及其蛋白水平，海馬TRKA、P75NTR免疫陽性顆粒積分光密度值明顯低于野生對照及野生干

9、預(yù)組，差異均有統(tǒng)計學意義; AD模型干預(yù)組小鼠上述指標明顯高于AD模型組，差異均有統(tǒng)計學意義。NgfmRNA及其蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。
　　5、SFN改善AD模型小鼠腦組織的自噬水平
　　AD模型組小鼠腦組織自噬小泡紅色熒光積分光密度值、腦皮質(zhì)及海馬LC3蛋白水平明顯低于野生對照組和野生干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計學意義;AD模型干預(yù)組小鼠腦組織自噬小泡紅色熒光積分光密度值、腦皮質(zhì)及海馬LC3蛋白水平明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計

10、學意義。
　　6、SFN上調(diào)AD模型小鼠腦皮質(zhì)組蛋白乙?；?br>　　與野生對照組及野生干預(yù)組相比，AD模型組小鼠腦皮質(zhì)Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白相對表達量降低，差異均有統(tǒng)計學意義。與野生對照組相比，野生干預(yù)組小鼠腦皮質(zhì)Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白相對表達量上升，差異均有統(tǒng)計學意義。與AD模型組相比，AD模型干預(yù)組小鼠腦皮質(zhì)Ace-H3K9、Ace-H4K12蛋白相對表達量上升，差異均有統(tǒng)計學意義。<

11、br>　　7、SFN提高Aβ25～35處理SH-SY5Y細胞活力
　　隨著Aβ劑量的增加，Aβ處理組細胞活力逐漸下降，其中40、80μM Aβ處理的細胞活力低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義。SFN預(yù)處理后各組細胞活力未見明顯改變。與Aβ處理組相比，SFN可減輕40、80μMAβ處理所致的細胞活力下降，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　8、SFN對Aβ25～35處理的SH-SY5Y細胞組蛋白乙?；郊皶r相分布
　　(1) Ace

12、-H3K9蛋白表達水平及時相分布
　　與對照組相比，12h、24 h時單純SFN組細胞Ace-H3K9蛋白表達水平上升;6h、12 h、24 h時Aβ處理組細胞Ace-H3K9蛋白表達水平下降，12h、24 h時，SFN干預(yù)組細胞Ace-H3K9蛋白表達水平均高于Aβ處理組。
　　(2) Ace-H4K12蛋白表達水平及時相分布
　　與對照組相比，24 h時單純SFN組細胞Ace-H4K12蛋白表達水平上升(P＜0.0

13、5);6 h、12h、24 h時Aβ處理組細胞Ace-H4K12蛋白表達水平下降(P＜0.01)。6h、12h、24 h時，SFN干預(yù)組細胞Ace-H4K12蛋白表達水平高于Aβ處理組（P＜0.01）。
　　9、SFN對Aβ25～35處理的SH-SY5Y細胞Hdac2mRNA及其蛋白水平的影響及時相分布
　　(1) Hdac2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及時相分布
　　與對照組相比，1h、3h、6h、12h、24 h時，單純SF

14、N組細胞Hdac2mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降(P＜0.05或P＜0.01);3h、6h、12 h、24 h時Aβ處理組細胞Hdac2mRNA轉(zhuǎn)錄水平上升(P＜0.01);1 h、3h、6h、12h、24 h時，SFN干預(yù)組細胞Hdac2mRNA轉(zhuǎn)錄水平低于Aβ處理組(P＜0.05或P＜0.01)。
　　(2) HDAC2蛋白表達水平及時相分布
　　與對照組相比，3h、6h、12h、24 h時單純SFN組細胞HDAC2蛋白表達水平下

15、降(P＜0.05或P＜0.01);6h、12h、24 h時Aβ處理組細胞HDAC2蛋白表達水平上升(P＜0.01);6h、12h、24 h時SFN干預(yù)組細胞HDAC2蛋白表達水平低于Aβ處理組(P＜0.01)。
　　結(jié)論
　　1、SFN可改善APPswe/PS1 dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的認知功能損傷、腦皮質(zhì)及海馬膽堿能神經(jīng)元丟失及Aβ沉積，并上調(diào)其降低的Psd95mRNA及其蛋白表達水平。
　　2、APPswe/P

16、S1 dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦組織Trka、P75ntr mRNA及蛋白水平下降，SFN干預(yù)可減輕上述變化，各組小鼠Ngf mRNA及蛋白水平無明顯差異;SFN干預(yù)可減緩APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦組織自噬水平、腦組織組蛋白乙?；降慕档?。
　　3、SFN對Aβ25～35所致的SH-SY5Y細胞活力下降具有明顯的改善作用。Aβ25～35處理的SH-SY5Y細胞Hdac mRNA及蛋白表達增多，Ace-H3