通心絡(luò)對(duì)β-淀粉樣蛋白腦室注射所致阿爾茨海默病模型大鼠干預(yù)作用研究.pdf

1、目的:采用β-淀粉樣蛋白(amyloid-beta protein,Ap)腦室注射方法建立阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)大鼠模型,并用通心絡(luò)進(jìn)行干預(yù),通過(guò)觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、血清和腦組織勻漿中氧化應(yīng)激、腦組織勻漿膽堿能相關(guān)指標(biāo)、免疫組化檢測(cè)海馬β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)表達(dá)、剛果紅染色檢測(cè)海馬Aβ表達(dá)、Westerblot檢測(cè)海馬tau蛋白表達(dá)的改

2、變,為通心絡(luò)臨床治療AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)一通心絡(luò)對(duì)Aβ所致AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響
　　 健康雄性SD大鼠70只,體重250～300g,隨機(jī)分為7組:(1)正常組；(2)假手術(shù)組；(3)模型組；(4)通心絡(luò)小劑量組(0.6g生藥/kg.d)；(5)通心絡(luò)中劑量組(1.2g生藥/kg.d)；(6)通心絡(luò)大劑量組(2.4g生藥/kg.d)；(7)金納多組(0.032g生藥/kg.d)。用

3、側(cè)腦室注射Aβ的方法建立AD大鼠模型,假手術(shù)組注射等量生理鹽水,手術(shù)3天后進(jìn)行藥物干預(yù),正常組、假手術(shù)組、模型組給予相同劑量的生理鹽水。給藥21天后,采用Morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠的平均逃避潛伏期時(shí)間和游泳總路程,共6d。
　　 實(shí)驗(yàn)二通心絡(luò)對(duì)Aβ所致AD模型大鼠氧化應(yīng)激的影響
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥同實(shí)驗(yàn)一,給藥30天后,大鼠頸總動(dòng)脈取血,分離血清,斷頭取腦,切取海馬部位勻漿離心,黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD的含量,

4、硫代巴比妥酸(TBA)比色分析法檢測(cè)MDA含量,化學(xué)比色法檢測(cè)GSH-Px活性。
　　 實(shí)驗(yàn)三通心絡(luò)對(duì)Aβ所致AD模型大鼠膽堿能系統(tǒng)功能的影響
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥同實(shí)驗(yàn)一,給藥30天后,大鼠斷頭取腦,切取海馬部位勻漿離心,用硫代丁酰膽堿比色法檢測(cè)ChE酶活性,比色法檢測(cè)AchE酶活性。
　　 實(shí)驗(yàn)四通心絡(luò)對(duì)Aβ所致AD模型大鼠海馬APP、Aβ表達(dá)的影響
　　 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法同實(shí)驗(yàn)一。給藥30天后

5、,大鼠心臟灌注取腦,4％多聚甲醛固定,常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明后,浸蠟,石蠟包埋,皮質(zhì)和海馬連續(xù)切片,免疫組化檢測(cè)海馬APP的表達(dá)。切片脫蠟至水,甲醇剛果紅染液染色,用堿性乙醇分化液分化,水洗,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封固,檢測(cè)大腦海馬Aβ的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)五通心絡(luò)對(duì)Ap所致AD模型大鼠海馬磷酸化Tau蛋白的影響
　　 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法同實(shí)驗(yàn)一。給藥30天后,斷頭取腦,快速切下海馬,研磨后進(jìn)行蛋白定量,Weste

6、rnblot檢測(cè)各組大鼠海馬Tau蛋白表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果:
　　 1各組大鼠水迷宮行為學(xué)的改變結(jié)果顯示
　　 1.1潛伏期(s):實(shí)驗(yàn)期間,與正常組比較,模型組逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而假手術(shù)組和正常組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)第1d,各用藥組與模型組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)；第2d通心絡(luò)大、小劑量組、金納多組與模型組相比潛伏期明顯縮短,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

7、0.05,P<0.01)；第3-6d,各用藥組潛伏期與模型組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。
　　 1.2總路程(cm):實(shí)驗(yàn)期間,與正常組比較,模型組游泳總路程明顯延長(zhǎng),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而假手術(shù)組和正常組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。第1d,各用藥組與模型組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)；從第2d開始,金納多組與模型組相比總路程明顯縮短(P<0.01)；第3d,通心絡(luò)中劑量組,金納多組與模

8、型組相比總路程明顯縮短(P<0.05)；第4、5d通心絡(luò)大、中、小劑量組,與模型組相比總路程縮短有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.01),第6d,各用藥組總路程均縮短,其中通心絡(luò)中、小劑量組、金納多組與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。
　　 2.各組大鼠SOD、GSH-Px、MDA活性的改變結(jié)果顯示
　　 2.1各組大鼠腦組織勻漿SOD、GSH-Px、MDA活性的改變結(jié)果顯示與正常組相比,模型組S

9、OD、GSH-Px活性顯著降低,MDA含量顯著升高,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各指標(biāo)假手術(shù)組與正常組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比,各用藥組SOD活性均明顯升高,MDA含量均顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)；GSFt-Px活性,與模型組相比,通心絡(luò)大、中劑量組活性均明顯增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而通心絡(luò)小劑量組、金納多組與模型組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　 2.2

10、各組大鼠血清中SOD、GSH—Px、MDA活性的改變結(jié)果顯示與正常組相比,模型組SOD活性、GSH-Px活性顯著降低,MDA含量顯著升高,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各指標(biāo)假手術(shù)組與正常組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比,各用藥組SOD活性均明顯增高,MDA含量均顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)；而GSH-Px活性,僅見通心絡(luò)大劑量組明顯增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.各組

11、大鼠ChE、AchE酶活性的改變結(jié)果顯示與正常組相比,模型組ChE、AchE酶活性顯著升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而假手術(shù)組與正常組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比,各用藥組ChE、AchE酶活性均明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 4.各組大鼠海馬區(qū).APP、Ap表達(dá)的改變
　　 4.1各組大鼠海馬區(qū)APP表達(dá)的改變結(jié)果顯示正常組:APP少量陽(yáng)性細(xì)胞,且染色較弱,表達(dá)量較低,海馬區(qū)與大

12、鼠大腦皮質(zhì)部分均有少量分布。假手術(shù)組:APP少量陽(yáng)性細(xì)胞,且染色較弱,表達(dá)量較低,海馬區(qū)與大鼠大腦皮質(zhì)部分均有少量分布。模型組:APP陽(yáng)性細(xì)胞大量表達(dá),且多呈強(qiáng)陽(yáng)性染色,廣泛分布于海馬區(qū),大鼠大腦皮質(zhì)部分分布。通心絡(luò)大中小劑量組可見APP陽(yáng)性細(xì)胞,染色較強(qiáng),有一定表達(dá),海馬區(qū)廣泛分布,大鼠大腦皮質(zhì)部分有少量分布。金納多組可見APP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目表達(dá)很多,多成強(qiáng)陽(yáng)性染色,廣泛分布于海馬區(qū),大鼠大腦皮質(zhì)部分分布。
　　 4.2各組大鼠

13、海馬區(qū)Ap表達(dá)的改變結(jié)果顯示正常組:剛果紅染色陰性,尼氏小體豐富清晰。假手術(shù)組:剛果紅染色陰性,尼氏小體豐富清晰。模型組:剛果紅染色呈陽(yáng)性反應(yīng),神經(jīng)元尼氏小體著色淡,結(jié)構(gòu)紊亂不清晰。通心絡(luò)大劑量組:剛果紅染色呈陽(yáng)性反應(yīng),神經(jīng)元尼氏小體著色淡。通心絡(luò)中劑量組:剛果紅染色呈陽(yáng)性反應(yīng),神經(jīng)元尼氏小體著色淡。通心絡(luò)小劑量組:剛果紅染色呈陽(yáng)性反應(yīng),神經(jīng)元尼氏小體著色淡。金納多組:染色呈陽(yáng)性反應(yīng),神經(jīng)元尼氏小體著色淡,結(jié)構(gòu)紊亂不清晰。
　　

14、 5.各組大鼠海馬區(qū)磷酸化Tau蛋白表達(dá)的改變結(jié)果顯示與正常組相比,模型組磷酸化Tau蛋白OD值明顯升高,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而假手術(shù)組與正常組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比,各用藥組磷酸化Tau蛋白OD值明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.絡(luò)病學(xué)說(shuō)是中醫(yī)理論特色組成部分
　　 元?dú)馓澨摱碌拿}絡(luò)瘀阻是癡呆發(fā)病及加重的關(guān)鍵因素及重要病理環(huán)節(jié),

15、氣血津液運(yùn)行失常,體內(nèi)生理或病理產(chǎn)物不能及時(shí)排除,蓄積體內(nèi),生成瘀血,瘀血阻滯脈絡(luò),脈絡(luò)“血主濡之”功能失常,即脈絡(luò)在末端發(fā)生的供血供氣、津血互換、營(yíng)養(yǎng)代謝三大功能活動(dòng)功能失常,不能為氣絡(luò)功能活動(dòng)提供物質(zhì)基礎(chǔ),氣絡(luò)失去血液及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濡養(yǎng),就會(huì)更加加重氣絡(luò)損傷,溫煦調(diào)養(yǎng)和信息傳達(dá)功能失常,而出現(xiàn)癡呆證候。
　　 2.通心絡(luò)可以顯著改善Aβ腦室注射所致AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的障礙,其作用可能是通過(guò)減輕體內(nèi)體內(nèi)自由基增多引起的