旋覆花素對阿爾茨海默病的干預及其機制的實驗研究.pdf

1、阿爾茨海默病(AD)是一種常見的老年神經(jīng)變性疾病，臨床上表現(xiàn)為進行性認知功能障礙和精神異常。 單味中藥的某一類化學成分藥理作用明確，療效穩(wěn)定，毒副作用小，符合當前的醫(yī)療市場要求，對防治老年癡呆有著良好的市場前景。歐亞旋覆花(Inula Britannica，)是一種傳統(tǒng)的中草藥，其化學成分有40多種，旋覆花內(nèi)酯(ABL)是從歐亞旋覆花的氯仿提取物中分離出的有效單體成分，體外證實旋覆花內(nèi)酯通過抑制NF-k B的激活而消除LPS誘導

2、的炎癥相關基因如環(huán)加氧酶(COX-2)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等的表達而發(fā)揮抑制巨噬細胞活化和抗炎作用?；贏D是一種慢性炎癥性疾病，旋覆花素是旋覆花單體有效成分的特定組合，本研究通過觀察旋覆花素對A β誘導的AD模型大鼠的干預效應，探討其作用機制，旨在確定該有效部位的藥用價值和作用途徑。 1.旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織COX-2，iNOS基因表達的影響 腦內(nèi)慢性炎癥反應是AD的重要病理特征，多種炎癥因子能

3、促進COX-2和iNOS的表達，COX-2和iNOS及其催化產(chǎn)物又可促進炎癥的進一步發(fā)展，直接或間接引起神經(jīng)元的死亡。本實驗采用免疫組織化學及Western blot方法，分別觀察旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織炎性基因COX-2，iNOS表達的影響。實驗結(jié)果如下： 1.1旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織COX-2基因表達的影響 作為炎癥相關基因，COX-2廣泛參與機體的炎癥反應，本實驗觀察了旋覆花素對COX-2表達的影

4、響。對照組海馬組織COX-2陽性染色細胞數(shù)量少，且?guī)缀醪恢?；模型組海馬組織COX-2陽性染色細胞數(shù)量多，著色深；旋覆花素給藥組大鼠COX-2陽性染色細胞數(shù)量較模型組減少，著色較淺，但仍比對照組數(shù)量多，著色深。Western blot顯示，對照組海馬組織COX-2表達量低，模型組海馬組織表達量顯著增高，給予旋覆花素治療后，大鼠腦海馬組織COX-2表達量明顯下降。以上結(jié)果提示旋覆花素可以抑制A β誘導的.AD模型大鼠腦海馬組織的COX-2

5、基因的表達。 1.2旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織iNOS基因表達的影響 激活的小膠質(zhì)細胞活化iNOS產(chǎn)生大量具有神經(jīng)毒性的NO，導致神經(jīng)元死亡。本實驗觀察了旋覆花素對iNOS表達的影響。對照組海馬組織iNOS陽性染色細胞數(shù)量少，且?guī)缀醪恢?；模型組海馬組織iNOS陽性染色細胞數(shù)量多，著色深；旋覆花素給藥組大鼠iNOS陽性染色細胞數(shù)量較模型組減少，著色較淺，但仍比對照組數(shù)量多，著色深。Western blot顯示，對照

6、組海馬組織iNOS表達量低，模型組海馬組織表達量顯著增高，給予旋覆花素治療后，大鼠腦海馬組織iNOS表達量明顯下降。以上結(jié)果提示旋覆花素可以抑制A β誘導的AD模型大鼠腦海馬組織iNOS基因的表達。 1.3海馬組織形態(tài)學改變 形態(tài)學分析可見，正常大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目多，呈多層，排列整齊緊密。核呈圓形，大而清晰，核仁明顯。神經(jīng)纖維密集，排列整齊。模型組呈現(xiàn)典型的AD病變，可見海馬神經(jīng)元細胞數(shù)目明顯減少，脫失現(xiàn)象明顯，層次少而

7、不清，排列紊亂。核固縮為三角形或多角形，濃染。神經(jīng)纖維稀疏，排列紊亂，間隙擴大，神經(jīng)元周圍有大量小膠質(zhì)細胞浸潤，表明本研究建立的模型是成功的。而旋覆花素給藥組大鼠上述神經(jīng)元損傷明顯減輕，海馬神經(jīng)細胞數(shù)目明顯增加，排列較整齊，核固縮現(xiàn)象明顯改善，核仁較明顯。神經(jīng)纖維數(shù)目也明顯增加，排列較整齊。 1.4旋覆花素對大鼠學習記憶行為的影響 采用Morris水迷宮進行測試，結(jié)果顯示，隨著訓練時段的增加，所有動物尋找站臺的潛伏期越來

8、越短，表明三組大鼠通過學習，均可對水下的站臺產(chǎn)生空間定位記憶。訓練第1天，模型組大鼠和旋覆花素給藥組大鼠差別不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，對照組大鼠與模型組大鼠、旋覆花素給藥組大鼠比較平均潛伏期延長，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明模型組大鼠和旋覆花素給藥組大鼠確有空間學習記憶能力的障礙；訓練第2、3、4天，模型組大鼠平均潛伏期明顯延長，與對照組大鼠、旋覆花素給藥組大鼠比較差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而旋覆花素給藥組大

9、鼠與對照組大鼠比較，兩者之間的差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示旋覆花素可以改善A β誘導的AD模型大鼠的空間學習記憶障礙；訓練第5天，三組大鼠達穩(wěn)定水平，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在空間搜索中實驗中模型組大鼠最后一次跨平臺次數(shù) (7.6±1.78)，較對照組大鼠(12.4±2.73)及旋覆花素給藥組大鼠(9.8±2.23)減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上數(shù)據(jù)提示本實驗造模是成功的，旋覆花素可有效改善AD

10、模型大鼠行為學指標。 2.旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織NF-κB、PPAR γ基因表達的影響 NF-κB是一種多向性轉(zhuǎn)錄因子，它的結(jié)合序列存在于多種促炎和促增殖基因的調(diào)控區(qū)中，通過激活靶基因表達，在免疫、炎癥、細胞周期調(diào)控、細胞增殖分化與凋亡等方面發(fā)揮重要的作用。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族。PPARs的活性降低與炎癥介質(zhì)的水平上升密切相關。近來研究認為PPAR

11、s在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有重要作用，尤其PPAR γ在腦內(nèi)的表達與炎癥和神經(jīng)退行性變緊密聯(lián)系。為了進一步探討旋覆花素抑制AD模型大鼠海馬炎癥反應、改善記憶功能的機制，在本部分實驗中，采用免疫組織化學及Western blot方法進一步研究旋覆花素對NF-κB、PPAR γ激活的影響，以揭示旋覆花素抑制iNOS、COX-2表達的分子機制，為探明旋覆花素抑制AD腦炎癥反應提供實驗依據(jù)。其結(jié)果如下： 2.1旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織

12、NF-k B基因表達的影響 NF-k B是炎癥反應的關鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。為了探討NF-k B在旋覆花素抑制A β誘導的AD模型大鼠腦海馬炎癥中的作用，本實驗檢測了NF-k B在大鼠腦海馬組織中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組海馬組織p50陽性染色細胞數(shù)量少，著色淺；模型組海馬可見大量p50陽性染色細胞，染色細胞數(shù)量多，著色深；旋覆花素給藥組海馬組織p50陽性染色細胞數(shù)量較模型組顯著減少，著色淺。Western blot分析顯示，在對照組

13、細胞中p50主要分布于細胞漿中，細胞核中僅有少量的p50存在；Aβ誘導的AD模型大鼠腦海馬組織細胞核內(nèi)p50水平明顯升高；服用旋覆花素的給藥組大鼠腦海馬組織細胞核中p50的表達量與模型組相比顯著減少。三組海馬組織細胞漿中p50的含量無明顯差異。從上述實驗結(jié)果可以看出，旋覆花素具有抑制A β誘導的AD模型大鼠腦海馬組織p50表達與核轉(zhuǎn)位的效應。 2.2旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織PPAR γ基因表達的影響 PPAR γ

14、可抑制NF-k B基因的表達，與腦內(nèi)炎癥反應及A β沉積密切相關。為了探討旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織PPAR γ表達的影響，我們檢測了PPAR γ在海馬內(nèi)的表達。Western blot顯示，對照組海馬組織表達量高，模型組海馬組織表達量顯著降低，給予旋覆花素治療后，大鼠腦海馬組織PPAR γ表達量明顯上調(diào)。提示旋覆花素具有促進A β誘導的AD模型大鼠腦海馬組織的PPAR γ表達的作用。 3.旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬神經(jīng)

15、細胞凋亡的影響 細胞凋亡是貫穿于機體生命過程始終，普遍存在的一種由基因活動指導下的細胞主動性死亡現(xiàn)象。神經(jīng)細胞凋亡是AD等退行性疾病發(fā)展過程中的重要事件，凋亡的神經(jīng)細胞是不可逆的，但處于凋亡過程中的神經(jīng)細胞存在不同程度的可逆性。本部分實驗觀察了旋覆花素對A β海馬內(nèi)注射誘導AD模型大鼠腦海馬組織凋亡相關基因變化的影響，以期從凋亡角度闡明旋覆花素對AD的防治作用及其機制。 結(jié)論: 1.旋覆花素顯著抑制Aβ誘導的AD

16、模型大鼠腦海馬組織炎癥基因iNOS、COX-2表達，抑制海馬炎癥反應。 2.旋覆花素通過抗炎作用而改善Aβ誘導的AD模型大鼠的空間學習記憶障礙。 3.旋覆花素顯著抑制AD模型大鼠腦海馬組織的NF-κB基因表達，而增強PPARγ基因表達，從而抑制炎癥基因的表達。 4.旋覆花素主要通過抑制促凋亡基因Bax以及Caspase-3的表達，抑制Aβ誘導的AD模型大鼠腦海馬的神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)細胞的保護作用，而對凋亡抑制