阿爾茨海默病腦內(nèi)Aβ的外周途徑清除研究.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默病(AD)是一種與衰老密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，以進(jìn)行性認(rèn)知能力下降和社會(huì)功能障礙為臨床特點(diǎn)。AD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前應(yīng)用的臨床藥物僅為對(duì)癥治療，無(wú)法防止病情進(jìn)展。β淀粉樣蛋白(Amyloidbeta，Aβ)是AD重要的致病物質(zhì)。Aβ產(chǎn)生和清除平衡障礙導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ過(guò)度沉積，被認(rèn)為是散發(fā)型AD(約占全部AD的99％)主要的發(fā)病原因。清除腦內(nèi)Aβ是AD防治的一個(gè)重要策略。Aβ清除包括從中樞途徑清除（中

2、樞清除）和從外周途徑清除（外周清除）。因此，明確機(jī)體Aβ外周清除的能力和機(jī)制，闡明Aβ外周清除能力在AD發(fā)生中的作用，對(duì)于深入理解AD發(fā)生機(jī)制，建立安全有效的AD防治措施，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用前景。
　　方法：
　　1.機(jī)體外周臟器組織的Aβ清除能力的檢測(cè)
　　納入30例房室折返性心動(dòng)過(guò)速患者，在射頻消融術(shù)中，采集上腔靜脈、下腔靜脈（肝靜脈開(kāi)口近端）、股動(dòng)脈和股靜脈血液，分離血清。同時(shí)，采用APP/PS1轉(zhuǎn)基因

3、AD小鼠10只，通過(guò)手術(shù)方法采集頸靜脈、腹主動(dòng)脈和后腔靜脈血液，分離血清。采用ELISA方法，檢測(cè)成人和APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠循環(huán)系統(tǒng)不同部位血液Aβ水平，比較靜脈血與動(dòng)脈血Aβ水平的比值。
　　2.外周臟器組織Aβ代謝能力的檢測(cè)
　　采用野生型C57BL/6J小鼠14只，進(jìn)行放射性同位素實(shí)驗(yàn)，通過(guò)尾靜脈注射1251標(biāo)記的Aβ，2小時(shí)后采集各主要外周臟器和組織，利用伽馬射線計(jì)數(shù)器測(cè)量各個(gè)主要外周臟器和組織的放射性計(jì)數(shù)，

4、觀察Aβ在外周主要臟器和組織的生物分布。
　　3.并聯(lián)共生動(dòng)物模型的建立
　　建立并聯(lián)共生(Parabiosis)動(dòng)物模型，通過(guò)手術(shù)方法將APP/PS1小鼠同野生型C57BL/6J小鼠進(jìn)行并聯(lián)，借此給APP/PS1小鼠增加一套完整的外周系統(tǒng)。預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，采用3月齡雌性APP/PS1小鼠（此時(shí)小鼠腦內(nèi)尚無(wú)大量Aβ沉積及病理改變形成）與同齡同性別野生型小鼠并聯(lián)，9月齡時(shí)進(jìn)行組織取材及檢測(cè)。治療實(shí)驗(yàn)中，采用9月齡雌性APP/PS1

5、小鼠（此時(shí)小鼠腦內(nèi)已有大量Aβ沉積及病理改變形成）與同齡同性別野生型小鼠并聯(lián)，12月齡時(shí)進(jìn)行組織取材及檢測(cè)。
　　4.AD腦內(nèi)Aβ水平的檢測(cè)
　　采用剛果紅染色、免疫組化染色、ELISA檢測(cè)，觀察并聯(lián)共生對(duì)APP/PS1小鼠腦內(nèi)老年斑、Aβ沉積以及腦組織提取液內(nèi)Aβ水平的影響。采用剛果紅染色、免疫熒光雙重標(biāo)記以及普魯士藍(lán)染色，觀察并聯(lián)共生對(duì)APP/PS1小鼠腦血管淀粉樣變(CAA)和腦微出血的影響。采用免疫蛋白印跡，觀察并聯(lián)

6、共生對(duì)APP/PS1小鼠腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白(APP)及其代謝產(chǎn)物、與Aβ合成和分解有關(guān)的酶以及轉(zhuǎn)運(yùn)受體的影響。
　　5.AD腦內(nèi)相關(guān)病理的檢測(cè)
　　采用免疫組化染色、免疫熒光多重標(biāo)記、ELISA檢測(cè)以及免疫蛋白印記，觀察并聯(lián)共生對(duì)APP/PS1小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、細(xì)胞因子水平、Tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響。采用免疫熒光雙重標(biāo)記和免疫蛋白印記，觀察并聯(lián)共生對(duì)APP/PS1小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元缺失、凋亡和突觸變性壞死的

7、影響。
　　結(jié)果：
　　1.機(jī)體存在天然的Aβ外周清除能力
　　通過(guò)比較上述比值顯示，成人上腔靜脈血Aβ40和總Aβ(Aβ40+Aβ42)水平顯著高于股靜脈血，股靜脈血Aβ40和總Aβ水平顯著高于下腔靜脈血。同時(shí)，APP/PS1小鼠頸靜脈血Aβ40和總Aβ水平顯著高于后腔靜脈血。另外，3月齡野生型小鼠尾靜脈注射1251標(biāo)記的Aβ后2小時(shí)，皮膚、胃腸道和肝臟放射性計(jì)數(shù)占總放射性計(jì)數(shù)的比值明顯高于心臟、脾臟、肺臟和腦，肝臟

8、、腎臟、胃腸道和皮膚單位重量臟器放射性計(jì)數(shù)顯著高于其他臟器。
　　2.并聯(lián)共生顯著預(yù)防Aβ在AD腦內(nèi)沉積
　　預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，采用剛果紅染色，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠腦內(nèi)剛果紅染色陽(yáng)性面積占總觀察面積百分比(Area fraction％)較對(duì)照組APP/PS1小鼠明顯減少，其中，新皮層減少約77.43％，海馬減少約71.22％。同時(shí)，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠單位面積腦片上剛果紅染色陽(yáng)性顆粒的數(shù)量(Plaque No./m

9、m2)較對(duì)照組APP/PS1小鼠明顯減少，其中，新皮層減少約80.10％，海馬減少約76.58％。采用6E10抗體免疫組化染色，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠腦內(nèi)6E10抗體免疫組化染色陽(yáng)性面積占總觀察面積百分比(Area fraction％)較對(duì)照組APP/PS1小鼠明顯減少，其中，新皮層減少約85.97％，海馬減少約82.62％。同時(shí)，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠單位面積腦片上6E10抗體免疫組化染色陽(yáng)性顆粒的數(shù)量(Plaque No

10、./mm2)較對(duì)照組APP/PS1小鼠明顯減少，其中，新皮層減少約80.49％，海馬減少約83.56％。此外，腦組織提取液內(nèi)Aβ測(cè)定顯示，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ40在TBS、2％SDS、70％甲酸三種提取液中的水平均明顯低于對(duì)照組APP/PS1小鼠。同時(shí)，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ42在三種提取液中的水平亦明顯低于對(duì)照組APP/PS1小鼠。進(jìn)一步計(jì)算腦內(nèi)總Aβ(Aβ40+Aβ42)可見(jiàn)，9月齡并聯(lián)APP/PS1小

11、鼠腦內(nèi)總Aβ無(wú)論是各個(gè)提取液內(nèi)的水平，還是各種提取液內(nèi)水平之和，均明顯低于對(duì)照組APP/PS1小鼠。另外，較對(duì)照組APP/PS1小鼠而言，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠CAA面積占比和平均數(shù)量以及腦內(nèi)微出血數(shù)量均明顯減少。同時(shí)，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠腦內(nèi)APP及其代謝產(chǎn)物C末端片段(C terminal fragment，CTF)-α、CTF-β，Aβ生成限速酶BACE1及Aβ降解酶IDE、NEP，Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)受體LRP-1和RAGE的

12、表達(dá)無(wú)變化。
　　3.并聯(lián)共生顯著抑制AD腦內(nèi)Aβ沉積的增長(zhǎng)
　　治療實(shí)驗(yàn)中，采用剛果紅染色，12月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠新皮層剛果紅染色陽(yáng)性面積占總觀察面積百分比(Area fraction％)較對(duì)照組APP/PS1小鼠明顯減少約17.10％(1.4134±0.0888 vs1.7049±0.0396，P＜0.05)，同時(shí)，新皮層單位面積腦片上剛果紅染色陽(yáng)性顆粒的數(shù)量(Plaque No./mm2)較對(duì)照組APP/PS1

13、小鼠明顯減少約16.94％(76.0826±3.7654 vs87.9899±4.6522，P＜0.05)。治療實(shí)驗(yàn)中，12月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠新皮層6E10抗體免疫組化染色陽(yáng)性面積占總觀察面積百分比(Area fraction％)較對(duì)照組APP/PS1小鼠明顯減少約36.02％(48.6341±2.2949 vs76.0197±3.7302，P＜0.01)，海馬減少約26.72％(23.2100±1.6363 vs36.6794

14、±2.4699，P＜0.01)。同時(shí)，新皮層單位面積腦片上6E10抗體免疫組化陽(yáng)性染色顆粒的數(shù)量(Plaque No./mm2)較對(duì)照組APP/PS1小鼠明顯減少約28.60％(115.1200±4.1091 vs161.2300±5.9683，P＜0.01)。
　　4.并聯(lián)共生顯著減輕AD相關(guān)病理特征
　　較對(duì)照組APP/PS1小鼠而言，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CD45抗體、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFA

15、P抗體免疫組化染色陽(yáng)性區(qū)域面積占觀察區(qū)域總面積占比(Area fraction％)顯著減少，單位面積腦片上免疫組化染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量(Cell No./mm2)顯著減少。同時(shí)，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠腦勻漿內(nèi)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平較對(duì)照組APP/PS1小鼠顯著降低。另外，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化位點(diǎn)標(biāo)志物pS396抗體免疫組化染色陽(yáng)性區(qū)域面積占觀察區(qū)域總面積占比(Area fractio

16、n％)顯著減少，單位面積腦片上pS396抗體免疫組化染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量(Cell No./mm2)顯著減少。同時(shí)，與對(duì)照組APP/PS1小鼠比較，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠腦勻漿內(nèi)pS396、pS199蛋白免疫印跡條帶相對(duì)密度明顯減少。同時(shí)，9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN抗體及CA1區(qū)神經(jīng)元標(biāo)志物MAP-2抗體免疫熒光標(biāo)記陽(yáng)性區(qū)域面積占觀察區(qū)域總面積占比(Areafraction％)顯著增多，海

17、馬CA3區(qū)細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Caspase-3抗體免疫熒光陽(yáng)性標(biāo)記區(qū)域面積占觀察區(qū)域總面積占比(Area fraction％)顯著減少。9月齡并聯(lián)APP/PS1小鼠腦勻漿內(nèi)突觸后膜標(biāo)志物PSD-93和PSD-95以及突觸前膜標(biāo)志物Synapsin-1和Synaptophysin表達(dá)明顯增高。
　　結(jié)論：
　　1.生理?xiàng)l件下，外周臟器組織具有清除腦內(nèi)Aβ的能力，肝臟、腎臟、腸道和皮膚是Aβ外周清除的重要部位。
　　2.增強(qiáng)A

18、β外周清除能力可以減少AD腦內(nèi)老年斑、Aβ沉積及腦組織提取液內(nèi)Aβ水平，減少CAA及其導(dǎo)致的腦微出血等Aβ相關(guān)病理。
　　3.增強(qiáng)Aβ外周清除能力可以減輕AD腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、降低細(xì)胞因子水平、減輕Tau蛋白過(guò)度磷酸化。同時(shí)，Aβ外周清除能力減輕AD腦內(nèi)神經(jīng)元缺失、凋亡，減少突觸變性壞死。
　　4.Aβ外周清除是AD防治的有效途徑，值得進(jìn)一步探索。
　　5.由于AD小鼠腦內(nèi)約40％的Aβ流向外周而被清除