TXNIP-Wnt在1型糖尿病心肌缺血后血管新生中的作用.pdf

1、近年來全世界范圍內(nèi)糖尿病發(fā)病率迅猛增長,糖尿病患者以每年超過700萬的速度遞增。目前我國糖尿病患者超過9400萬,已成為全世界糖尿病第一大國;此外,尚有約1.5億人群還處于糖尿病前期狀態(tài)。心血管并發(fā)癥是糖尿病患者的“頭號(hào)殺手”,糖尿病患者冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高2-4倍,超過75％糖尿病患者因冠心病住院,并有超過50%的患者因冠心病死亡。更為重要的是,糖尿病不僅增加心肌梗死的發(fā)病率,而且增加心肌梗死后心絞痛、心衰、死亡的發(fā)生率。目前國內(nèi)外針對(duì)

2、糖尿病心肌組織損害的治療策略,仍不能從根本上遏制糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展,糖尿病患者心血管并發(fā)癥的發(fā)生率和死亡率仍然居高不下,防治任務(wù)還十分艱巨。
　　心肌缺血導(dǎo)致的血管新生及側(cè)支循環(huán)建立對(duì)于改善和維持缺血心肌的血供具有重要影響。臨床研究表明,糖尿病明顯抑制缺血心肌側(cè)支循環(huán)的建立,表現(xiàn)為糖尿病心肌梗死后毛細(xì)血管及小動(dòng)脈的密度顯著低于非糖尿病組,這可能是糖尿病加重冠心病死亡率的重要途徑,但其內(nèi)在機(jī)制尚不清楚。糖尿病患者由于存在

3、植物神經(jīng)病變,往往發(fā)生無痛性心肌缺血甚至無痛性心肌梗死,并不能及時(shí)就醫(yī),因此代償性血管新生及側(cè)支循環(huán)的建立對(duì)于糖尿病患者的預(yù)后顯得尤為重要,有助于維持其心臟的功能,延緩心力衰竭,減少猝死的發(fā)生率。闡明血管新生的關(guān)鍵機(jī)制對(duì)于改善糖尿病心梗預(yù)后具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。
　　硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)作為近些年在糖尿病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)分子,介導(dǎo)了胰島β細(xì)胞損傷過程,在糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中占有關(guān)鍵地位。TXNIP的啟動(dòng)子區(qū)含

4、有碳水化合物反應(yīng)元件ChoRE,其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均受血糖調(diào)控。根據(jù)目前國內(nèi)外取得的研究進(jìn)展,我們在本研究中提出如下問題:
　?、偬悄虿』颊唧w內(nèi)的TXNIP呈高表達(dá)狀態(tài),是糖尿病、高糖狀態(tài)早期反應(yīng)基因,并最終導(dǎo)致了細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為反應(yīng)。糖尿病對(duì)缺血心肌血管新生的影響是否也與TXNIP有關(guān)呢?
　　②Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育過程中調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和分化,在心臟發(fā)育、血管生成、心肌肥

5、厚、動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。TXNIP是否可以通過Wnt/β-catenin發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)功能呢?
　?、踂nt/β-catenin信號(hào)通路在小鼠心梗后可被激活,缺血心肌冠脈內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin核轉(zhuǎn)位增加,而糖尿病條件下心肌梗死后心臟內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平如何?所有上述問題都需要進(jìn)一步深入研究。
　　【目的】
　　1.構(gòu)建糖尿病心梗模型,明確糖尿病心肌梗死時(shí)心臟血管新生、側(cè)支循環(huán)建立受

6、損與糖尿病加重心肌梗死損傷的相關(guān)性。
　　2.分析糖尿病心肌梗死中TXNIP與β-catenin的表達(dá)變化,探討糖尿病心肌梗死時(shí)心臟血管新生、側(cè)支循環(huán)建立受損的機(jī)制。
　　3.明確β-catenin在糖尿病心肌梗死心臟血管新生、側(cè)支循環(huán)建立受損中的地位,闡明糾正Wnt部分恢復(fù)糖尿病心梗后血管再生能力的機(jī)制。
　　【研究方法】
　　1.選取8周齡C57雄性小鼠,連續(xù)5天腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)50 mg/kg,

7、以連續(xù)3次隨機(jī)血糖>11.1 mmol/L視為糖尿病造模成功。在糖尿病模型的基礎(chǔ)上,通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支構(gòu)建糖尿病小鼠心肌梗死模型。
　　2.將小鼠隨機(jī)分為4組,分別為:非糖尿病+假手術(shù)組(CS)、糖尿病+假手術(shù)組(DS)、非糖尿病+心梗組(CMI)、糖尿病+心梗組(DMI)。心梗4天后檢測心臟內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡,內(nèi)皮細(xì)胞 TXNIP和β-catenin蛋白和超氧陰離子水平,心梗30天時(shí)檢測心臟血管密度、心功能。
　　3

8、.將糖尿病心梗小鼠隨機(jī)分為2組:糖尿病+心梗組(DMI)、糖尿病+心梗(DMI)+氯化鋰(LiCl)組,心梗4天后檢測心臟內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡,內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin蛋白水平,心梗30天后檢測心臟血管密度、心功能。
　　4.采用TUNEL與CD31免疫熒光雙標(biāo)法,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡下觀察各組小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況。
　　5.分別采用CD31和Ki67,CD31和TXNIP,CD31和β-catenin免疫熒光雙標(biāo)法,應(yīng)

9、用激光共聚焦顯微鏡觀察各組小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞增殖、TXNIP和β-catenin表達(dá)情況。
　　6.采用CD31免疫組化法,觀察各組小鼠心臟血管密度情況。
　　7.采用小動(dòng)物超聲的方法,檢測各組小鼠心功能變化。
　　8.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),隨機(jī)分為以下5組:
　　A.對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(22 mmol/L葡萄糖、33 mmol/L葡萄糖);
　　B.對(duì)照組(5.5 m

10、mol/L葡萄糖)、高糖(33 mmol/L葡萄糖)+ si NC組、高糖(33 mmol/L葡萄糖)+si TXNIP組;
　　C.對(duì)照組(5.5 mmol/L)、高糖(33 mmol/L)+si NC組、高糖(33 mmol/L)+si TXNIP組、高糖(33 mmol/L)+H2O2組、高糖(33 mmol/L)+H2O2+si TXNIP組;
　　D.對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖)、對(duì)照(5.5 mmol/L

11、葡萄糖)+Wnt3a(200 ng/ml)組、高糖組(33 mmol/L葡萄糖)、高糖(33 mmol/L葡萄糖)+Wnt3a(200 ng/ml)組;
　　E.對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖)、對(duì)照(5.5 mmol/L葡萄糖)+LiCl(200μmol/L)組、高糖組(33 mmol/L葡萄糖)、高糖(33 mmol/L葡萄糖)+LiCl(200μmol/L)組。
　　9.采用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測β-catenin活性

12、。
　　10.通過實(shí)時(shí)定量PCR法檢測TXNIP、Cyclin D1、C-myc轉(zhuǎn)錄水平。
　　11.通過Western blotting、免疫熒光法檢測TXNIP、β-catenin蛋白水平。
　　12.采用超氧化物陰離子探針檢測各組心肌ROS水平。
　　13.采用流式細(xì)胞儀檢測各組HUVEC細(xì)胞周期。
　　14.采用MTT法檢測各組HUVEC細(xì)胞增殖能力。
　　15.采用劃痕和Transwell法

13、檢測各組HUVEC細(xì)胞遷移能力。
　　【研究結(jié)果】
　　1.糖尿病組心臟收縮功能輕度下降,內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加;與非糖尿病組相比,糖尿病組合并心梗時(shí)心肌收縮功能顯著下降,心臟內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯增加;與非糖尿病組相比,糖尿病組合并心梗時(shí),心臟內(nèi)皮細(xì)胞增殖顯著減少,心臟血管密度下降。
　　2.糖尿病組心臟及心臟內(nèi)皮細(xì)胞TXNIP表達(dá)水平明顯升高,β-catenin核轉(zhuǎn)位減少,高糖培養(yǎng)條件下HUVEC細(xì)胞TXNIP表達(dá)水平明顯升高

14、,熒光報(bào)告系統(tǒng)β-catenin讀數(shù)顯著降低,核轉(zhuǎn)位減少,β-catenin下游Cyclin D1、C-myc轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào),呈濃度依賴性降低。與非糖尿病組相比,糖尿病組發(fā)生心梗時(shí)心臟及心臟內(nèi)皮TXNIP表達(dá)明顯升高,β-catenin核轉(zhuǎn)位減少;與非糖尿病組相比,糖尿病組發(fā)生心梗時(shí)ROS生成顯著增加。
　　3.與高糖組比較,si RNA干涉TXNIP可以誘導(dǎo)熒光報(bào)告系統(tǒng)β-catenin讀數(shù)明顯恢復(fù);高糖加用活性氧清除劑NAC

15、,熒光報(bào)告系統(tǒng)讀數(shù)明顯恢復(fù);高糖加用si RNA干涉TXNIP基礎(chǔ)上,加用H2O2時(shí)熒光報(bào)告系統(tǒng)β-catenin讀數(shù)明顯下調(diào)。
　　4.Wnt3a(200 ng/ml)處理36 h促進(jìn)了β-catenin,核轉(zhuǎn)位增加;高糖組β-catenin表達(dá)量和核轉(zhuǎn)位都明顯減少,加用Wnt3a時(shí)部分恢復(fù)了β-catenin的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。
　　5.高糖處理36 h,代表HUVEC細(xì)胞增殖的S期與G1期比值減少,細(xì)胞生長明顯受到抑制;外

16、源性補(bǔ)充Wnt3a可以部分恢復(fù)S期與G1期比值,部分恢復(fù)HUVEC增殖能力;高糖培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞遷移能力受到抑制,外源性補(bǔ)充Wnt3a可以部分恢復(fù)HUVEC遷移能力;高糖可以抑制熒光報(bào)告系統(tǒng)β-catenin讀數(shù)以β-cateni與核轉(zhuǎn)位,加用LiCl(200μmol/L)熒光報(bào)告系統(tǒng)β-catenin讀數(shù),以及β-catenin核轉(zhuǎn)位明顯恢復(fù)。
　　6.腹腔注射LiCl(200 mg/kg)部分恢復(fù)糖尿病心肌梗死導(dǎo)致心臟內(nèi)皮細(xì)

17、胞β-catenin活性減少,促進(jìn)了心臟內(nèi)皮細(xì)胞增殖,減少了心臟內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　7.腹腔注射LiCl(200 mg/kg)可以部分恢復(fù)糖尿病心肌梗死導(dǎo)致的血管生成障礙,增加血管密度,改善左室收縮功能。
　　【結(jié)論】通過本課題的研究,我們發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌缺血后代償性血管生成減少,首次發(fā)現(xiàn)了TXNIP在糖尿病心肌梗死周邊區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)升高及其對(duì)血管發(fā)生的影響,明確了TXNIP作為潛在的抑制血管新生基因?qū)υ鲋场⑦w移相關(guān)基因β-