白藜蘆醇減輕2型糖尿病小鼠心肌缺血-再灌注損傷及機(jī)制.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景：
　　2型糖尿?。═2DM）患病率逐年升高，因其血管病發(fā)癥而導(dǎo)致的缺血性心臟病發(fā)病率也隨之升高，且糖尿病可導(dǎo)致心肌易損性增加，從而進(jìn)一步加重心肌缺血/再灌注（MI/R）損傷。研究顯示，白藜蘆醇（RSV）具有多種心血管保護(hù)作用，其中包括減輕心肌缺血/再灌注損傷，目前認(rèn)為其主要是通過增加NO生成的預(yù)處理效應(yīng)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，但具體機(jī)制仍未完全闡明。據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇能夠上調(diào)培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞及正常小鼠的脂聯(lián)素水平及多聚化。因此，

2、脂聯(lián)素或可成為RSV對(duì)缺血心肌發(fā)揮保護(hù)作用的中介分子。脂聯(lián)素（APN）是一種血漿含量豐富的脂肪細(xì)胞因子（0～30μg/ml），具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗糖尿病和心血管保護(hù)等作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，補(bǔ)充外源性脂聯(lián)素球狀片段（gAPN）能夠顯著減輕正常、脂聯(lián)素基因敲除及糖尿病小鼠的心肌缺血/再灌注（MI/R）損傷。但是，脂聯(lián)素在循環(huán)血液中只有極少量以單體形式存在，而主要形成三聚體（LMW）、六聚體（MMW）和高分子量聚合體（HMW）等三種形式

3、的聚合體，且三種聚合體分別有各自的作用靶點(diǎn)和生物學(xué)活性。流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病和冠心病患者HMW水平顯著下降，且血漿HMW含量或HMW占總脂聯(lián)素的比例（HMW％）與糖尿病性缺血性心臟病的危險(xiǎn)程度顯著相關(guān)，故內(nèi)源性脂聯(lián)素含量及其多聚化水平（即HMW％）的升高更有益于預(yù)防和治療糖尿病性心血管病。因此，運(yùn)用白藜蘆醇提高內(nèi)源性脂聯(lián)素表達(dá)及多聚化或可成為治療糖尿病冠心病的新策略。但是，在2型糖尿病時(shí)，白藜蘆醇是否能夠通過逆轉(zhuǎn)其低脂聯(lián)素血癥從而在

4、缺血/再灌注損傷時(shí)發(fā)揮心肌保護(hù)作用仍不清楚。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.通過建立2型糖尿病小鼠心肌MI/R模型，驗(yàn)證白藜蘆醇飼喂是否能夠減輕2型糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注損傷。
　　2.如果白藜蘆醇飼喂能夠減輕T2DM小鼠MI/R損傷，則進(jìn)一步闡明其可能的機(jī)制，即RSV是否能夠上調(diào)T2DM小鼠的血漿及脂肪脂聯(lián)素水平及其多聚化，從而激活脂聯(lián)素信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.模型的建立

5、采用喂養(yǎng)高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ)建立T2DM小鼠模型。通過檢測(cè)體重、血糖、空腹血漿胰島素水平以及口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT），確認(rèn)模型是否建立成功。采用結(jié)扎心臟冠狀動(dòng)脈左前降支30min、再灌注3h或24h建立MI/R模型。
　　2.給藥途徑及方法T2DM小鼠模型建立成功后立即給予RSV(10mg/kg)每日1次灌胃，連續(xù)3周。AMPK抑制劑CompoundC（20mg/kg）于術(shù)前1h腹腔注射。
　　3.心

6、肌缺血/再灌注損傷及脂聯(lián)素水平的檢測(cè)用伊文氏藍(lán)/TTC雙重染色法檢測(cè)心梗面積，小動(dòng)物超聲檢測(cè)心功能，TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，ELISA法檢測(cè)caspase-3活性、血漿脂聯(lián)素水平，Westernblot法檢測(cè)心肌組織AMPK和p-AMPK水平、脂肪組織DsbA-L和脂聯(lián)素的含量及血漿和脂肪組織HMW水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.小鼠T2DM及MI/R模型的建立喂養(yǎng)高脂飲食結(jié)合小劑量STZ能夠成功建立T2DM小鼠模型。

7、高脂飼喂后小鼠體重顯著增加、血糖顯著升高（飼喂8周后血糖>11.0mmol/L）、空腹血漿胰島素水平明顯升高、口服葡萄糖耐量顯著降低，符合T2DM小鼠造模標(biāo)準(zhǔn)。MI/R后，經(jīng)伊文氏藍(lán)/TTC雙重染色，心肌組織分別被染成代表正常組織的藍(lán)色區(qū)、代表缺血組織的紅色區(qū)和代表梗死組織的白色區(qū)，證明模型建立成功。
　　2.RSV飼喂對(duì)T2DM小鼠MI/R損傷的影響RSV飼喂能夠顯著減輕T2DM小鼠MI/R損傷，減小心梗面積、增強(qiáng)心功能、減少心

8、肌細(xì)胞凋亡（P<0.01），降低caspase-3的活性（P<0.05）。
　　3.RSV減輕T2DM小鼠MI/R損傷的機(jī)制T2DM小鼠脂聯(lián)素水平降低、MI/R損傷加重（P<0.01）。RSV能夠通過增加脂肪組織DsbA-L的表達(dá)（P<0.05），上調(diào)血漿及脂肪組織APN水平及其多聚化（P<0.01），增加HMW含量。AMPK抑制劑CompoundC可顯著抑制AMPK的磷酸化，降低心肌p-AMPK的水平（P<0.05），從而明顯削