人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)生成內(nèi)皮祖細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長的作用研究及機(jī)制初探.pdf

1、近年來，內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的研究與應(yīng)用價值受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注，對內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)育分化調(diào)控機(jī)制及其應(yīng)用價值的研究日益拓展和深入。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）作為血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，在一定的條件下可以增生并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而有望在很多臨床治療中扮演重要角色。但內(nèi)皮祖細(xì)胞來源非常有限，其只占外周血單個核細(xì)胞的0.02-0.1％。人胚胎干細(xì)胞（hESCs）為目前最為重要的再生醫(yī)學(xué)種子細(xì)胞之一，與其他干細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的增殖能力、多能性

2、及低免疫原性，由hESCs誘導(dǎo)分化為EPCs有望成為我們獲得EPCs或者是內(nèi)ECs的重要來源。但是，hESCs向ECs總體分化效率不高，如何獲取足夠數(shù)量的有功能的ECs仍是當(dāng)前面臨的最大挑戰(zhàn)。除此之外，hESC體外向EPCs/ECs的分化亦為研究內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性以及內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育分化的調(diào)控機(jī)制提供了不可多得的模型。
　　 內(nèi)皮細(xì)胞像一把雙刃劍，不僅在再生醫(yī)學(xué)中具有非常重要的價值，其本身的增殖又與異常血管發(fā)育、惡性腫瘤等多種疾病

3、的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。目前，探討血管內(nèi)皮細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)下的增殖發(fā)育與功能發(fā)揮的調(diào)控機(jī)制，從而開展以血管內(nèi)皮為靶標(biāo)的治療受到越來越多的關(guān)注，如VEGF在惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用日益明確，VEGF抗體的臨床價值受到廣泛肯定。研究表明，作為實體腫瘤顯著生理學(xué)特征的低氧是VEGF重要誘導(dǎo)因素之一，而低氧的生物學(xué)作用無疑主要是通過低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（HIF）介導(dǎo)完成的。那么，HIF在血管內(nèi)皮增殖及其生物學(xué)功能的發(fā)揮中扮演怎樣的角色是值得關(guān)注

4、的問題。HIF家族中最重要的一個成員是HIF-1，其活性主要與α亞基有關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α被抑制之后，腫瘤細(xì)胞的生長與浸潤等生物學(xué)活性是否受到影響，如果是，HIF-1α又是通過怎樣的機(jī)制發(fā)揮其作用的?對這些問題的回答無疑將有助于我們更好的理解血管內(nèi)皮細(xì)胞對于腫瘤細(xì)胞的作用，為進(jìn)一步以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)的腫瘤治療提供新的策略。
　　 基于此，本課題的研究分為二部分完成：
　　 一.人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)生成內(nèi)皮祖細(xì)胞<

5、br>　　 保持良好干性的hESCs經(jīng)膠原酶消化后，與MEF共培養(yǎng)，利用4步程序性誘導(dǎo)方法使其向內(nèi)皮祖細(xì)胞分化：含有BMP4（10ng/ml）的培養(yǎng)基培養(yǎng)4天→去除BMP4后培養(yǎng)6天→使用MiniMACS系統(tǒng)分選CD34+細(xì)胞→使用EGM-2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-10天。對誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)、特異基因表達(dá)及功能等方面的系列檢測，與此同時，對誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞在EGM-2培養(yǎng)體系中繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。
　　 結(jié)果表明：誘導(dǎo)后的細(xì)胞呈

6、梭形，形態(tài)均一，生長穩(wěn)定，原代及傳代后的細(xì)胞RT-PCR法均能檢測到內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因CD31、CD34、VE-cad、KDR、vWF、eNOS及平滑肌相關(guān)基因α-SMA；免疫熒光染色表達(dá)CD31、VE-cad和VEGF；能夠吞噬低密度脂蛋白，并在Matrigel基質(zhì)膠上形成管腔樣結(jié)構(gòu)；更換為平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基后，細(xì)胞增寬，體積增大，α-SMA基因表達(dá)增強(qiáng)22倍，免疫熒光染色可檢測到α-SMA蛋白。不同代數(shù)細(xì)胞基因表達(dá)差異不明顯。說明hES

7、Cs可以有效的誘導(dǎo)為EPCs，EPCs具有內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞雙向分化能力。
　　 二.內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長的作用研究及機(jī)制初探
　　 在本部分實驗中，我們首先分離、培養(yǎng)并鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），進(jìn)而明確內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用，利用裸鼠成瘤性實驗明確內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用。與此同時，在以上實驗基礎(chǔ)上我們利用SiRNA干涉內(nèi)皮細(xì)胞的HIF-1α的表達(dá)，初步探討HIF-1α在內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)

8、功能發(fā)揮中所扮演的角色。
　　 結(jié)果表明：內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，侵襲能力，促進(jìn)移植瘤的生長，參與并促進(jìn)腫瘤血管形成；腫瘤細(xì)胞上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)。SiRNA干涉內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)后，體外對腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力的促進(jìn)明顯下降，體內(nèi)移植瘤生長速度及腫瘤血管密度與單獨(dú)移植腫瘤組無明顯差異，但較正常內(nèi)皮細(xì)胞組明顯下降。說明HIF-1α在內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)腫瘤血管形成過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。
　　 本課題通