慢性炎癥相關(guān)因素對AFG1誘導(dǎo)肺腺癌的影響及可能機制研究.pdf

1、黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類真菌毒素，具有較強致癌性，1993年被IARC列為“A級可能人類致癌物”。AF除了與肝癌發(fā)生密切相關(guān)外，呼吸道也是其重要致癌靶點。大量研究證實經(jīng)呼吸道或經(jīng)飲食途徑攝入AF可以誘導(dǎo)肺癌的發(fā)生。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素G1(AFG1)是河北省南部腫瘤高發(fā)區(qū)日常食品主要污染的真菌毒素之一。長期口服AFG1可以誘導(dǎo)NIH小鼠發(fā)生肺腺癌，其腫瘤細胞來源于Ⅱ型肺泡上皮細胞

2、（AT-Ⅱ）。外源性致癌物煙草、石棉通過誘導(dǎo)肺部慢性炎癥導(dǎo)致肺癌發(fā)生，是目前比較公認(rèn)的致癌途徑之一。炎癥反應(yīng)長期遷延，在肺組織局部形成慢性炎癥微環(huán)境，可以造成靶細胞DNA損傷、細胞突變、增殖以及血管增生等改變，從而促進靶細胞惡性增殖和肺癌的發(fā)生發(fā)展。大量文獻報道AT-Ⅱ是包括AFB1在內(nèi)多種致癌物誘導(dǎo)肺腺癌的靶細胞，在肺癌發(fā)生中具有重要作用。肺組織炎癥反應(yīng)可以誘導(dǎo)AT-Ⅱ與免疫調(diào)控相關(guān)表型發(fā)生改變，如上調(diào)MHC-Ⅱ，增加COX-2表達，

3、分泌免疫抑制性細胞因子IL-10和TGF-β，進而誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞發(fā)揮免疫抑制作用，刺激外周幼稚T細胞向調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)分化，促進肺癌發(fā)生發(fā)展。此外，慢性炎癥反應(yīng)可能加劇了靶細胞中ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)DNA損傷，在細胞癌變的啟動階段發(fā)揮重要作用。因此肺組織炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞發(fā)生改變，可能在AFG1誘導(dǎo)肺腺癌發(fā)生中起重要作用。
　　本研究室最近研究發(fā)現(xiàn)氣管內(nèi)一次性給予AFG1后，大鼠肺部出現(xiàn)一過性炎癥改變和AT-Ⅱ細胞

4、損傷。但是，AFG1是否能誘導(dǎo)慢性炎癥產(chǎn)生，進而導(dǎo)致肺癌發(fā)生并未明了。如若AFG1誘導(dǎo)肺部慢性炎癥反應(yīng)，是否誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞上與免疫調(diào)控相關(guān)的表型發(fā)生改變？是否誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷尚不清楚。研究經(jīng)口長期給予AFG1對肺組織炎癥反應(yīng)的影響，并探討其對AT-Ⅱ細胞的影響及機制，對揭示AFG1致肺癌機制具有重要意義。
　　本研究旨在明確長期灌胃AFG1對肺部炎癥反應(yīng)的影響，及其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用;探討AFG1誘導(dǎo)的慢性炎

5、癥反應(yīng)對AT-Ⅱ細胞表型及功能的影響，以及對AT-Ⅱ細胞氧化應(yīng)激損傷的作用。本實驗共分三部分，第一部分觀察長期灌胃AFG1后，Balb/c小鼠肺部是否發(fā)生了慢性炎癥反應(yīng)，及其在肺癌發(fā)生中的作用;第二部分:體外培養(yǎng)具有人AT-Ⅱ細胞特征的A549細胞和原代分離培養(yǎng)的人正常AT-Ⅱ細胞，探討AFG1對AT-Ⅱ細胞表型成熟的影響;給予TNF-α和AFG1共同作用模擬AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，探討其對A549細胞表型改變和細胞因子分泌功能的影

6、響及機制;第三部分探討TNF-α和AFG1共同作用，對A549細胞氧化應(yīng)激損傷的影響及其可能作用機制。通過以上三個部分從體內(nèi)到體外的研究，探討AFG1致肺癌的可能作用及其作用機制，豐富人們對黃曲霉素致癌性的認(rèn)識，為進一步做好食品衛(wèi)生安全防控提供理論依據(jù)和合理處置位點。
　　第一部分長期灌胃黃曲霉毒素G1誘導(dǎo)慢性肺部炎癥并促進肺腺癌發(fā)生作用的研究
　　目的:探討長期灌胃黃曲霉毒素G1對Balb/c小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的影響，及其

7、在肺腺癌發(fā)生中的作用。
　　方法:1按照我研究組前期灌胃AFG1誘導(dǎo)NIH小鼠肺腺癌的動物造模方法，經(jīng)口給予Balb/c小鼠灌胃AFG16個月（每周3次），停止灌胃AFG1。2在灌胃1周和1、3、6個月后隨機各取4只動物處死，采用常規(guī)HE染色和IHC染色觀察小鼠肺組織炎癥反應(yīng)以及炎細胞浸潤情況;以及炎癥反應(yīng)相關(guān)細胞因子和NF-κB和JAK/STAT3信號通路激活的情況。3采用熒光實時定量PCR(Real time PCR)、IHC

8、染色和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法檢測炎癥模型小鼠肺組織中主要炎癥相關(guān)細胞因子TNF-α的表達情況。4觀察灌胃AFG1小鼠肺組織中Ⅱ型肺泡上皮細胞增殖變化，以及血管生成情況。5采用IHC染色和Western Blot方法檢測灌胃AFG1小鼠肺組織中氧化應(yīng)激損傷標(biāo)志蛋白SOD-2和HO-1表達情況;以及COX-2的表達情況。6其余動物在灌胃6個月后停止灌胃AFG1，繼續(xù)飼養(yǎng)6個月，共1年后觀察肺腫瘤發(fā)生情況以及炎癥相關(guān)信

9、號通路和COX-2的表達情況，進一步評估AFG1誘導(dǎo)肺組織炎癥反應(yīng)是否介導(dǎo)肺腺癌的發(fā)生。
　　結(jié)果:
　　1灌胃AFG1對Balb/c小鼠生物學(xué)行為的影響
　　在AFG1灌胃、及灌胃后延長生存共12個月的觀察期間，兩組小鼠均無病亡，生長及生活狀態(tài)無差異，均未出現(xiàn)臨床疾病表現(xiàn)。
　　2灌胃AFG1期間Balb/c小鼠肺部組織病理學(xué)改變
　　隨著AFG1灌胃時間延長，處理組小鼠較對照組小鼠出現(xiàn)明顯的肺部慢性炎癥

10、反應(yīng)，細胞增殖，3-6個月時達高峰。HE染色表現(xiàn)為:肺泡壁增厚，間隔增寬，出現(xiàn)炎癥細胞浸潤和肺泡上皮增生。IHC染色顯示，浸潤細胞以CD68+的肺泡巨噬細胞和CD3+的淋巴細胞為主，主要定位于肺泡囊壁部位。提示長期口服AFG1主要造成肺泡壁慢性炎癥反應(yīng)。
　　3灌胃AFG1對Balb/c小鼠肺組織中主要炎癥相關(guān)細胞因子和趨化因子表達水平的影響
　　隨著給藥時間延長，處理組小鼠較對照組小鼠肺組織中TNF-α、 IL-6、IL-

11、1β、MCP-1/CCL-2、MIP-2/CXCL-2、CXCL-1的mRNA表達水平增高(P＜0.05)，TNF-α在AFG1處理組小鼠肺組織切片的肺泡上皮細胞和肺泡巨噬細胞中陽性表達，蛋白表達水平增高。
　　4灌胃AFG1對Balb/c小鼠肺組織中NF-κB p65和STAT3信號通路的影響
　　IHC染色顯示，NF-κB p65和P-STAT3在AFG1處理組小鼠肺組織的肺泡上皮細胞和炎癥浸潤細胞核中的表達水平較對照組

12、升高(P＜0.05)。提示口服AFG1可以激活肺組織NF-κB p65和STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　5灌胃AFG1對Balb/c小鼠肺組織中氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響
　　IHC染色結(jié)果顯示，AFG1處理組小鼠肺組織中氧化應(yīng)激損傷標(biāo)志蛋白SOD-2和HO-1陽性細胞較對照組明顯增多。Western blot檢測結(jié)果表明，AFG1處理組小鼠肺組織中SOD-2的蛋白表達水平較對照組升高(P＜0.05)。提示口服AFG1可以誘導(dǎo)Balb

13、/c小鼠肺組織中出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。
　　6灌胃AFG1對Balb/c小鼠肺組織中細胞增殖和血管生成的影響
　　IHC染色可見，AFG1處理組小鼠的肺組織中Ki67陽性細胞較對照組升高(P＜0.05)，且集中于肺泡壁和肺泡間隔部位，沿肺泡間隔走行;這些部位肺組織中SP-C陽性細胞數(shù)較對照組增多(P＜0.05)，與Ki67表達平行，增生細胞中未見CC-10陽性表達。提示AFG1可以誘導(dǎo)主要來源于AT-Ⅱ的細胞增殖。
　　W

14、estern blot結(jié)果顯示，AFG1處理組小鼠肺組織中VEGF的蛋白水平較對照組升高(P＜0.05)。IHC染色可以觀察到AFG1處理組小鼠的肺組織中VEGF陽性細胞較對照組增多。免疫熒光染色可見AFG1處理組小鼠肺組織中CD34表達較對照組升高。提示口服AFG1誘導(dǎo)的肺部慢性炎癥組織中血管增生活躍，微血管密度增加。
　　7灌胃AFG1對Balb/c小鼠肺泡上皮細胞中COX-2表達水平的影響
　　IHC染色觀察，可見AF

15、G1處理組小鼠的肺泡上皮細胞中COX-2陽性表達細胞較對照組增多。Western Blot檢測結(jié)果顯示，AFG1處理組小鼠肺組織中COX-2的蛋白表達水平升高(P＜0.05)。提示在AFG1誘導(dǎo)的肺部慢性炎癥組織中，肺泡上皮細胞中的COX-2表達水平上調(diào)。
　　8長期灌胃AFG1對Balb/c小鼠肺組織中炎癥相關(guān)性腫瘤形成的影響
　　連續(xù)給予AFG1處理6個月基礎(chǔ)上，繼續(xù)喂養(yǎng)6個月。12個月后，肺組織切片HE染色觀察發(fā)現(xiàn)15

16、只實驗組小鼠中，8只小鼠肺組織出現(xiàn)肺泡上皮不典型增生病灶或肺腺癌（各4只），對照組中小鼠未見到不典型增生或肺腺癌。IHC染色顯示，在不典型增生病灶和肺腺癌組織中，Ki67和SP-C陽性表達，CC-10未表達，提示AT-Ⅱ細胞異常增殖參與肺腺癌的發(fā)生;IHC染色顯示NF-κB p65、P-STAT3和COX-2在肺腺癌細胞中陽性表達。這些結(jié)果提示AFG1誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)可能在肺腺癌發(fā)生中起重要作用。
　　第二部分黃曲霉素G1和腫瘤壞

17、死因子α協(xié)同作用對肺泡Ⅱ型上皮細胞表型的影響及作用
　　目的:炎癥反應(yīng)可以誘導(dǎo)AT-Ⅱ表型發(fā)生改變:如上調(diào)MHC-Ⅱ和COX-2表達，促進免疫抑制性細胞因子IL-10和TGF-β分泌，進而誘導(dǎo)外周幼稚T淋巴細胞向調(diào)節(jié)性T細胞分化，抑制肺部免疫反應(yīng)，促進肺癌發(fā)生發(fā)展。因為在第一部分中我們發(fā)現(xiàn)在AFG1灌胃小鼠肺組織中，COX-2在AT-Ⅱ細胞中高表達，推測AFG1誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)可能誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞表型改變而發(fā)揮免疫抑制作用。所以我

18、們進一步在整體水平觀察在AFG1誘導(dǎo)的肺慢性炎癥反應(yīng)和肺腺癌中AT-Ⅱ細胞表型分子表達情況，及調(diào)節(jié)性T細胞的浸潤情況，評估AT-Ⅱ細胞表型改變與調(diào)節(jié)性T細胞浸潤的關(guān)系。為了探討AFG1誘導(dǎo)的肺慢性炎癥反應(yīng)影響AT-Ⅱ細胞表型改變機制，我們給予AFG1和TNF-α共同作用A549細胞，體外模擬黃曲霉素G1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，探討AFG1和TNF-α對AT-Ⅱ細胞表型的影響及機制。
　　方法:1采用第一部分的實驗標(biāo)本，IHC染色觀察A

19、FG1誘導(dǎo)的慢性肺炎和肺腺癌組織中MHC-Ⅱ，CD74和FoxP3的表達情況，探討AT-Ⅱ細胞表型改變與調(diào)節(jié)性T細胞浸潤的關(guān)系。2采用分離培養(yǎng)人AT-Ⅱ細胞和具有人AT-Ⅱ特征的A549細胞，F(xiàn)CM方法檢測其表面HLA-DR、CD80和CD86的表達情況，探討AFG1單獨作用對AT-Ⅱ細胞表型成熟的影響。3在第一部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)灌胃AFG1能上調(diào)炎癥細胞因子的表達，TNF-α作為其中核心細胞因子，在mRNA和蛋白水平上表達明顯增高，

20、所以我們給予AFG1和TNF-α聯(lián)合作用于A549細胞，檢測其對A549細胞表面HLA-DR，CD54，COX-2表達的影響。4探討p38和NF-κB通路在AFG1和TNF-α聯(lián)合作用影響AT-Ⅱ細胞表型改變中的作用。5采用Real-time PCR方法探討AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對A549細胞中細胞因子表達的影響及可能機制。
　　結(jié)果:
　　1 MHC-Ⅱ，CD74和FoxP3在AFG1誘導(dǎo)的慢性肺炎和肺腺癌組織中的表

21、達情況
　　IHC染色觀察，可見在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥肺組織和肺腺癌組織里，肺泡上皮細胞中IA/IE、CD74陽性細胞數(shù)增加，局部浸潤淋巴細胞和鄰近淋巴結(jié)中FoxP3表達增高。說明AFG1誘導(dǎo)慢性肺炎可能促進AT-Ⅱ細胞表面MHC-Ⅱ類分子高表達和肺組織Treg細胞浸潤。結(jié)果提示AT-Ⅱ細胞上調(diào)MHC-Ⅱ表達可能促進Treg細胞分化，在AFG1誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)的肺腺癌發(fā)生中發(fā)揮作用。
　　2 AFG1對A549細胞表型改變的

22、影響及可能機制
　　內(nèi)吞實驗表明，AFG1處理可以降低A549細胞吞噬能力，誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞成熟。FCM檢測結(jié)果表明，與溶劑對照組相比，AFG1處理后A549細胞表面HLA-DR、CD54表達明顯增高(P＜0.05)，但是缺失CD80和CD86的表達。提示AFG1處理可能誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞表型成熟，發(fā)揮抗原遞呈功能，但由于缺乏有效激活效應(yīng)性T細胞所必需的共刺激因子表達，這種成熟AT-Ⅱ細胞不能激活CD4+T細胞。p38信號通路可能在

23、AFG1誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞表型成熟，上調(diào)HLA-DR和CD54表達中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　3 AFG1對原代分離培養(yǎng)的AT-Ⅱ細胞表面HLA-DR、CD80和CD86表達的影響
　　FCM檢測結(jié)果顯示，給予AFG1處理后，原代AT-Ⅱ細胞上HLA-DR的表達水平明顯升高(P＜0.05)，而CD80和CD86仍缺失表達。實驗結(jié)果進一步表明AFG1促進AT-Ⅱ細胞表型成熟，但是缺乏CD86和CD80的表達，其在抗原遞呈中不能激活CD

24、4+T細胞。
　　4 AFG1+TNF-α聯(lián)合作用對A549細胞HLA-DR和CD54表達的影響
　　FCM檢測結(jié)果顯示，與AFG1單獨處理組相比，AFG1+TNF-α聯(lián)合作用明顯增加了HLA-DR和CD54的表達(P＜0.05)。提示在AFG1誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境中，TNF-α可以與AFG1協(xié)同作用促進AT-Ⅱ細胞表型成熟。
　　5 AFG1和TNF-α協(xié)同作用引起A549細胞表型改變可能的機制
　　Western

25、 Blot結(jié)果顯示，AFG1和TNF-α共同作用可以提前激活p38信號通路(P＜0.05)，并激活NF-κB信號通路，但是AFG1單獨作用不激活NF-κB通路。提示在AFG1誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，TNF-α激活NF-κB可能發(fā)揮重要作用。FCM結(jié)果表明，PDTC和SB203580預(yù)處理都可以抑制AFG1+TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的HLA-DR和CD54表達上調(diào)(P＜0.05)。提示在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥微環(huán)境中，AFG1和TNF-α發(fā)揮協(xié)同作用

26、激活p38通路，TNF-α單獨激活NF-κB通路，共同調(diào)節(jié)AT-Ⅱ細胞發(fā)生表型改變。
　　6 AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對A549細胞中COX-2表達的影響及可能途徑
　　Real-time PCR和Western Blot結(jié)果顯示，單獨給予TNF-α可以上調(diào)COX-2在mRNA和蛋白水平的表達(P＜0.05)，單獨給予AFG1對COX-2表達無影響，AFG1+TNF-α處理較單用TNF-α處理可以顯著增加COX-2表達水

27、平(P＜0.05)。PDTC預(yù)處理抑制了COX-2的mRNA和蛋白表達上調(diào)(P＜0.05)，而SB203580預(yù)處理對COX-2表達無影響。在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥微環(huán)境中，TNF-α-NF-κB信號通路發(fā)揮核心作用，促進AT-Ⅱ細胞高表達COX-2。
　　7 AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對A549細胞中細胞因子表達的影響及可能途徑
　　Real-time PCR結(jié)果顯示，AFG1單獨處理可以增加A549細胞中TNF-α、T

28、GF-β、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和MCP-1的mRNA表達(P＜0.05，F(xiàn)ig6 A)，而對MIP-2沒有影響;AFG1+TNF-α明顯發(fā)揮協(xié)同作用，進一步上調(diào)TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1和MIP-2的表達，其表達水平明顯高于AFG1單獨處理組(P＜0.05，F(xiàn)ig7 A)。提示AFG1和TNF-α發(fā)揮協(xié)同作用，誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞上調(diào)炎癥相關(guān)細胞因子表達，而AFG1獨自激活A(yù)T-Ⅱ細胞上調(diào)TGF-β

29、表達，參與肺部炎癥反應(yīng)或誘導(dǎo)免疫耐受。
　　TNF-α單獨激活NF-κB通路或和AFG1協(xié)同激活的p38通路共同發(fā)揮作用，調(diào)控AT-Ⅱ細胞分泌炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1和MIP-2以及炎癥抑制因子IL-10;但是TNF-α對AT-Ⅱ細胞分泌TGF-β沒有影響。而AFG1獨自激活p38信號通路調(diào)控AT-Ⅱ細胞表達TGF-β。提示AFG1誘導(dǎo)的慢性肺炎，可能通過激活NF-κB和p38信號通路誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞上調(diào)炎癥相

30、關(guān)細胞因子表達，促進肺部炎癥反應(yīng)和免疫耐受。AT-Ⅱ細胞高表達IL-10和TGF-β，可能進一步支持表型改變的AT-Ⅱ細胞促進Treg的活化。
　　綜合以上結(jié)果表明，在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥環(huán)境中，AT-Ⅱ細胞表型發(fā)生改變:HLA-DR、CD54和COX-2表達上調(diào)，免疫抑制性細胞因子TGF-β和IL-10分泌增加，但缺失CD80和CD86表達。TNF-α激活NF-κB信號通路或是聯(lián)合AFG1激活p38通路在這一表型改變中發(fā)揮重要

31、作用。這種表型改變的AT-Ⅱ細胞可能發(fā)揮免疫抑制功能，促進CD4+T細胞向Treg細胞分化，抑制對AFG1誘發(fā)腫瘤的免疫監(jiān)視功能，促進了肺腺癌發(fā)展。
　　第三部分黃曲霉素G1和腫瘤壞死因子α協(xié)同作用對肺泡Ⅱ型上皮細胞氧化應(yīng)激損傷的影響
　　目的:第一部分研究發(fā)現(xiàn)在AFG1誘導(dǎo)的肺組織慢性炎癥反應(yīng)中，肺泡壁上皮細胞高表達氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志蛋白SOD-2和HO-1，推測AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致AT-Ⅱ細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷

32、。本部分進一步給予AFG1和TNF-α共同作用A549細胞，體外模擬黃曲霉素G1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，探討AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對AT-Ⅱ細胞氧化應(yīng)激損傷的影響。
　　方法:1 FCM方法檢測AFG1處理對A549細胞中活性氧生成的影響。2采用堿性彗星實驗和Western blot方法檢測AFG1對A549細胞中氧化應(yīng)激損傷的影響。3采用FCM和Western Blot方法觀察AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對A549細胞氧化應(yīng)激

33、損傷的影響。4 Real time PCR和Western Blot方法檢測AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對A549細胞中Cyp450酶活性的影響。
　　5 Western Blot方法觀察NF-κB信號通路在AFG1和TNF-α聯(lián)合作用誘導(dǎo)A549細胞氧化應(yīng)激損傷中可能機制。
　　結(jié)果:
　　1 AFG1處理對A549細胞中活性氧生成的影響
　　FCM檢測結(jié)果顯示，AFG1處理組中DCF和DHE的平均熒光強度高于

34、對照組（P＜0.05），且平均熒光強度的水平隨著AFG1濃度的增加而增加。NAC預(yù)處理后，DCF和DHE的升高水平明顯降低，與未經(jīng)預(yù)處理的AFG1處理組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示AFG1可以提高A549細胞中ROS的水平。
　　2 AFG1對A549細胞中氧化應(yīng)激損傷的影響
　　堿性彗星實驗顯示，AFG1處理組細胞電泳后出現(xiàn)了“彗星”現(xiàn)象，彗星拖尾明顯;NAC預(yù)處理后，“彗星”現(xiàn)象明顯減少。Western

35、Blot結(jié)果表明，AFG1作用A549細胞24 h，γ-H2AX蛋白表達增加，該作用可被NAC預(yù)處理抑制(P＜0.05)。提示AFG1可以誘導(dǎo)A549氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細胞DNA雙鏈斷裂。
　　3 AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對A549細胞氧化應(yīng)激損傷的影響
　　FCM和Western Blot檢測結(jié)果表明，與AFG1單獨作用相比，TNF-α和AFG1聯(lián)合作用可以更早引起A549細胞中ROS產(chǎn)生增多(P＜0.05);γ-H2

36、AX和SOD-2的蛋白表達水平較AFG1單獨處理組也明顯增高(P＜0.05)。AFG1單獨作用對SOD-2表達沒有影響。說明TNF-α與AFG1聯(lián)合作用可以加速A549細胞中ROS產(chǎn)生，TNF-α可以促進AFG1誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加DNA雙鏈斷裂損傷。
　　4 AFG1和TNF-α聯(lián)合作用對A549細胞中Cyp450酶活性的影響
　　Real-time PCR結(jié)果顯示，Cyp2A13在AFG1、TNF-α單獨作用，或聯(lián)合

37、作用時表達水平均明顯增高，Cyp2A13在聯(lián)合作用組的表達明顯高于在AFG1單獨處理組(P＜0.05);Cyp2A6在AFG1單獨作用時表達變化不大，TNF-α與AFG1聯(lián)合作用可以明顯增加Cyp2A6的mRNA表達水平(P＜0.05)。Western Blot方法檢測了Cyp2A13的蛋白表達水平，結(jié)果與mRNA的表達情況一致。這表明TNF-α與AFG1可以協(xié)同作用上調(diào)Cyp2A13和Cyp2A6的表達，促進AFG1在A549細胞中代

38、謝活化，可能在加劇A549細胞DNA損傷中發(fā)揮重要作用。
　　5 NF-κB信號通路在AFG1和TNF-α聯(lián)合作用誘導(dǎo)A549細胞氧化應(yīng)激損傷中的作用
　　Western Blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合處理組中NF-κB p65蛋白在細胞核中表達增高，且可被PDTC預(yù)處理有效抑制(P＜0.05)。給予PDTC預(yù)處理后，聯(lián)合處理組中Cyp2A13和γ-H2AX的蛋白表達明顯低于未經(jīng)PDTC預(yù)處理的聯(lián)合作用組(P＜0.05)。表明A

39、FG1和TNF-α聯(lián)合作用可能是通過激活NF-κB信號通路上調(diào)Cyp2A13表達，促進AFG1代謝活化，進而加重細胞的DAN雙鏈斷裂損傷。
　　綜上所述，我們認(rèn)為在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)中，除了AFG1本身可以誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞氧化應(yīng)激損傷外，TNF-α與AFG1可以相互促進發(fā)揮協(xié)同作用，激活NF-κB信號通路，上調(diào)Cyp2A13表達，促進AFG1代謝活化，進一步提高細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，加劇細胞的DNA損傷，進而增加細胞突變幾率

40、。
　　結(jié)論:
　　1灌胃AFG1可以誘導(dǎo)Balb/c小鼠出現(xiàn)肺部慢性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為增加炎癥細胞浸潤，促進炎癥細胞因子和趨化因子釋放，激活NF-κB和STAT3信號通路，上調(diào)COX-2表達，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，肺泡Ⅱ型上皮細胞增殖活躍，血管增生。
　　2在AFG1誘導(dǎo)的肺組織慢性炎癥反應(yīng)中，起核心作用的炎癥細胞因子TNF-α表達明顯增高，可能在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　3延長灌胃AFG1誘導(dǎo)肺部慢性炎癥模型中

41、小鼠的存活期，小鼠肺部出現(xiàn)AT-Ⅱ細胞來源的不典型增生病灶和肺腺癌。肺腺癌組織中與炎癥反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)志物NF-κB，P-STAT3和COX-2表達增高。提示AFG1誘導(dǎo)肺部慢性炎癥反應(yīng)，提供促進腫瘤發(fā)生的微環(huán)境，可能在肺腺癌發(fā)生中起到重要作用。
　　4在AFG1誘導(dǎo)的肺部慢性炎癥和肺腺癌組織中，AT-Ⅱ細胞表面MHC-Ⅱ分子表達增高，Treg細胞浸潤增加。提示表型改變的AT-Ⅱ細胞可能發(fā)揮免疫抑制功能，誘導(dǎo)Treg細胞活化，參與肺腺

42、癌的發(fā)生。
　　5 AFG1可以通過p38信號通路誘導(dǎo)AT-Ⅱ細胞表型成熟，上調(diào)MHC-Ⅱ和CD54表達，但共刺激因子(CD80、CD86)低表達或缺如，這可能導(dǎo)致AT-Ⅱ細胞不能激活效應(yīng)性CD4+T細胞。
　　6 AFG1與TNF-α聯(lián)合作用促進AT-Ⅱ細胞表型發(fā)生改變:上調(diào)HLA-DR、CD54、COX-2表達，以及免疫抑制性細胞因子TGF-β和IL-10表達。提示AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致AT-Ⅱ細胞表型改變，進而

43、使其發(fā)揮免疫抑制功能，誘導(dǎo)幼稚CD4+T細胞向Treg細胞分化，促進肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。
　　7 AFG1與TNF-α聯(lián)合作用增加AT-Ⅱ細胞中ROS產(chǎn)生，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)DNA損傷。
　　8 TNF-α通過激活NF-κB信號通路，上調(diào)Cyp2A13表達，促進AFG1代謝活化，進而加劇DNA損傷。結(jié)果表明在AFG1誘導(dǎo)的慢性炎癥微環(huán)境中，TNF-α分泌增加，AFG1與TNF-α聯(lián)合作用加劇AT-Ⅱ細胞的DNA損傷，可能增