淫羊藿苷對卵蛋白和內(nèi)毒素誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的影響及機制研究.pdf

1、第一部分，淫羊藿替對卵蛋自誘導(dǎo)大鼠哮喘性氣道炎癥的影響
　　目的:觀察淫羊藿苷對卵蛋白誘導(dǎo)大鼠哮喘性氣道炎癥的影響。
　　方法:(1)72只雄性SD大鼠隨機分為6組,每組12只,分別是正常對照組(PBS)、模型組(OVA)、陽性對照組(OVA+地塞米松組)和OVA+淫羊藿苷低、中、高計量組(5、1O、20mg／kg-1);(2)采用卵蛋白(OVA)致敏和反復(fù)激發(fā)大鼠建立哮喘模型;(3)采用HE染色觀察淫羊藿苷對OVA誘導(dǎo)的大

2、鼠肺組織炎癥浸潤的干預(yù)作用及病理學(xué)評分的影響;(4)觀察6組外周血總細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞計數(shù)情況;(5)采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清中IL-4、IFN-γ、IL-13和TNF-α的含量;(6)取各組大鼠肺泡灌洗液,采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ的含量。
　　結(jié)果:(1)淫羊藿菅對大鼠哮喘模型肺組織病理學(xué)和炎癥分級評分影響的結(jié)果顯示:OVA+淫羊藿苷高劑量組支氣管、血管和周圍肺組織有炎性細(xì)胞浸

3、潤,支氣管上皮可見部分損傷,與模型組相比較,支氣管上皮和血管周圍的炎癥有所減輕。模型組大鼠肺組織炎癥評分明顯高于正常對照組,OVA+淫羊藿苷高劑量組與模型組相比較,炎癥評分降低,差異有顯著性(P＜0.05);(2)淫羊藿苷對大鼠哮喘模型外周血細(xì)胞計數(shù)的影響結(jié)果顯示:模型組外周血總細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與正常對照組相比較均顯著增加,OVA+淫羊藿苷高劑量組對嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抑制明顯,差異有顯著性(P＜0.05);(3)淫羊藿苷

4、對大鼠哮喘模型外周血細(xì)胞因子影響的結(jié)果顯示:模型組大鼠血清IL-4、IL-13和TNF-α水平與正常對照組相比較均顯著增加,血清IFN-γ,水平顯著降低。OVA+淫羊藿苷高、中劑量組對哮喘大鼠血清IL-4、IL-13和TNF-α水平抑制明顯,差異具有顯著性(P＜0.05),淫羊藿苷高劑量組能夠增加大鼠哮喘模型血清IFN-γ的表達(dá)水平,差異有顯著性(P＜0.05);(4)淫羊藿苷對大鼠哮喘模型肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ表達(dá)影響的結(jié)果

5、顯示:模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-4表達(dá)明顯高于正常對照組;OVA+淫羊藿苷高劑量組與哮喘模型組相比較,大鼠肺泡灌洗液中IL-4表達(dá)明顯降低,差異有顯著性(P＜0.05),哮喘模型組大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ表達(dá)明顯低于正常對照組,淫羊藿苷治療組與哮喘模型組相比較,大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ表達(dá)有所升高,差異有顯著性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)淫羊藿苷具有改善哮喘大鼠肺組織炎癥的作用;(2)淫羊藿苷具有抑制哮喘大鼠外周血嗜

6、酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集的作用;(3)淫羊藿菅具有抑制哮喘大鼠血清和肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞因子的作用。
　　第二部分，淫羊藿苷對大鼠哮喘性氣道炎癥影響的分子機制研究
　　目的:觀察淫羊藿苷對卵蛋白誘導(dǎo)大鼠Th1／Th2細(xì)胞因子失衡表達(dá)的影響及機理探討。
　　方法:(1)60只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組(PBS)、模型組(OVA誘導(dǎo))、地塞米松組、OVA+淫羊藿苷低、中、高劑量組(5、10、20mg/kg-1);(2)

7、采用卵蛋白(OVA)致敏和激發(fā)大鼠建立哮喘模型;(3)采用ELISA法觀察淫羊藿苷對各組大鼠肺組織IL-4和IFN-γ的含量的影響;(4)采用免疫組化染色觀察淫羊藿苷對各組大鼠肺組織T-bet和GATA-3的干預(yù)作用;(5)采用RealtimeRT-PCR法觀察淫羊藿苷對各組大鼠肺組織和脾臟淋巴細(xì)胞T-bet和GATA-3mRNA表達(dá)的干預(yù)作用;(6)采用Westernblot法觀察淫羊藿苷對各組大鼠肺組織T-bet、GATA-3和NF

8、-κBp65蛋白表達(dá)的干預(yù)作用。
　　結(jié)果:(1)各組大鼠肺組織ELISA結(jié)果顯示,OVA+淫羊藿苷中、高劑量組與哮喘模型組相比較,大鼠肺組織IL-4表達(dá)明顯降低,差異有顯著性(P＜0.05),大鼠肺組織IFN-γ表達(dá)有升高趨勢,但是無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);(2)各組大鼠肺組織GATA-3和T-bet免疫組化染色結(jié)果顯示,OVA+淫羊藿苷高劑量組GATA-3染色明顯減少,T-bet染色沒有明顯減少;(3)各組大鼠肺組織和脾臟

9、淋巴細(xì)胞T-bet和GATA-3mRNA表達(dá)結(jié)果顯示,淫羊藿苷治療組與哮喘模型組相比較,大鼠肺組織中T-bet和GATA-3mRNA表達(dá)明顯降低,差異有顯著性(P＜0.05);哮喘模型組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞中GATA-3和T-betmRNA表達(dá)明顯高于正常對照組,淫羊藿苷治療組與哮喘模型組相比較,大鼠肺組織中GATA-3mRNA表達(dá)明顯降低,差異有顯著性(P＜0.05),T-betmRNA表達(dá)有所降低,但是差異無顯著性(P＞0.05);(4

10、)各組大鼠肺組織T-bet和GATA-3蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示,模型組T-bet和GATA-3表達(dá)與PBS對照組相比較顯著增加,淫羊藿苷能夠抑制GATA-3蛋白的增加,而對T-bet的抑制作用不明顯;(5)各組大鼠肺組織NF-κBp65免疫組化染色結(jié)果顯示,OVA+淫羊藿苷高劑量組的支氣管、血管黏膜下和周圍肺組織有炎性細(xì)胞浸潤,NF-κBp65著色細(xì)胞較少,與模型組相比較,NF-κBp65陽性表達(dá)較少;(6)各組大鼠肺組織NF-κBp65蛋

11、白檢測結(jié)果顯示,淫羊藿苷治療組的p65總蛋白的表達(dá)減少,胞漿p65蛋白表達(dá)增加。
　　結(jié)論:(1)淫羊藿苷能夠調(diào)節(jié)哮喘大鼠肺組織Th1／Th2相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)失衡;(2)淫羊藿苷能夠調(diào)節(jié)哮喘大鼠肺組織和脾臟淋巴細(xì)胞中Th1/Th2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(T-bet／GATA-3)表達(dá)失衡;(3)淫羊藿苷具有抑制哮喘大鼠肺組織NF-κBp65蛋白激活的作用。
　　第三部分，淫羊藿苷調(diào)控內(nèi)毒素誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的體內(nèi)及體外實驗研究
　　目

12、的:本研究旨在探討淫羊霍苷在抑制LPS誘導(dǎo)的體內(nèi)和體外炎癥反應(yīng)中的作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　方法:(1)肺組織HE染色觀察淫羊藿苷對LPS誘導(dǎo)的急性炎癥的影響;(2)檢測肺組織髓過氧化物酶(MPO)觀察淫羊藿苷對LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響;(3)ELISA法觀察淫羊藿管對各組小鼠血清細(xì)胞因子的抑制作用(TNF-α,PGE2和NO);(4)Real-timeRT-PCR觀察淫羊藿苷對各組小鼠肺組織TNF-α、iNOS和COX-2mR

13、NA表達(dá)的影響;(5)Westernblot觀察淫羊藿苷對PI3K／AKT的激活作用;(6)共聚焦和EMSA觀察淫羊藿昔對NF-κBp65激活的抑制作用。
　　結(jié)果:淫羊藿苷(20mg／kg-1)干預(yù)后,能抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肺組織TNF-α、IL-6和COX-2mRNA表達(dá)的增加;淫羊藿昔能夠降低過氧化物酶(MPO)活性;在RAW264.7細(xì)胞中,淫羊藿苷對LPS的細(xì)胞毒作用具有保護作用;免疫印跡和共聚焦顯微鏡分析表明,淫羊藿苷