高尿酸對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、尿酸是鳥嘌呤和腺嘌呤代謝的主要代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能，當(dāng)病理情況下，尿酸水平持續(xù)升高，誘發(fā)炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞激活導(dǎo)致內(nèi)皮功能受損。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，尿酸不同程度的升高是糖尿病和冠心病的危險(xiǎn)因素之一，但是尿酸能否作為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，參與疾病的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后仍有較大爭(zhēng)議。近年來(lái)的國(guó)內(nèi)外的研究提示，在穩(wěn)定性心絞痛患者中，尿酸不同程度的升高與疾病的預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)，在急性冠脈綜合征患者中，高尿酸血癥與疾病的再發(fā)和死亡存在明顯關(guān)系，但是

2、與冠脈血管的嚴(yán)重程度沒有關(guān)系。本課題前期臨床研究也顯示，急性冠脈綜合征患者尿酸水平升高與其的預(yù)后相關(guān)，生存分析模型顯示，尿酸水平在500-600μmmol/L時(shí)，冠心病患者的預(yù)后較差。尿酸與冠心病的關(guān)系與其它傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素如高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙相比，其對(duì)心血管疾病的影響是單獨(dú)起作用還是協(xié)同其他因素作用仍不清楚。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于尿酸的研究多停留在臨床分析和少量的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對(duì)于高尿酸環(huán)境對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)的影響及其相關(guān)的機(jī)制并不

3、明了，有待進(jìn)一步研究。
　　目的：
　　研究不同濃度尿酸對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及其可能的相關(guān)機(jī)制。
　　對(duì)象和方法：
　　1.研究對(duì)象
　　人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。
　　2.研究方法
　　2.1 培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，用第4-6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　2.2 用CCK-8試劑盒及MTT試劑盒測(cè)定不同濃度尿酸對(duì)于人臍靜脈血管細(xì)胞的毒性和細(xì)胞增殖的影響。

4、>　　2.3 不同濃度尿酸及TNF-α預(yù)處理處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞:根據(jù)我們前期收集的冠心病人的臨床資料，將高尿酸水平進(jìn)行分層冠心病人群尿酸水平輕度升高平均值480μmmol/L，冠心病人群高尿酸水平的中度升高平均值590μmmol/L，冠心病人群高尿酸水平高度升高平均值700μmmol/L，確定用80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL的尿酸處理細(xì)胞，同時(shí)用10ng/mL的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基處理。利

5、用人腫瘤壞死因子-α（hTNF-α，10ng/ml）做為陽(yáng)性對(duì)照。
　　H1:0ng/ml，對(duì)照組
　　H2:hTNF-α:10ng/ml，陽(yáng)性對(duì)照組
　　H3:尿酸80μg/mL（冠心病人群高尿酸水平的輕度升高平均值）+hTNF-α(10ng/ml)組
　　H4:尿酸100μg/mL（冠心病人群高尿酸水平的中度升高平均值）+hTNF-α(10ng/ml)
　　H5:尿酸120μg/mL（冠心病人群高尿酸水

6、平的高度升高平均值）+hTNF-α(10ng/ml)組
　　2.4 過(guò)氧化氫試劑盒測(cè)定細(xì)胞外過(guò)氧化氫(H2O2)和用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧。
　　2.5 用ELISA測(cè)定ET-1(endothelin-1)、TF(tissue factor)等因子蛋白水平的表達(dá)。
　　2.6 用q-PCR測(cè)定ET-1、TF等因子mRNA水平的表達(dá)。
　　2.7 用Western Blotting測(cè)定炎癥因子ICAM-1、VC

7、AM-1、IL-18的表達(dá)和信號(hào)通路蛋白t/p-IKKα，t/p-IκBα和內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)。
　　3.統(tǒng)計(jì)方法
　　使用版本為19.0的SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)形式為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分析的方法對(duì)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行比較。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.當(dāng)尿酸濃度在80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL時(shí)HU

8、VEC的細(xì)胞活力未出現(xiàn)明顯下降(P＞0.05)，表明這三個(gè)濃度對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的活力基本無(wú)影響，當(dāng)尿酸濃度在200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL時(shí)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的活力則顯著下降(P＜0.05)。
　　2.H2O2在H1、H2、H3、H4、H5這五個(gè)組的表達(dá)為2.46±0.25μmmol/L、3.70±0.07μmmol/L、4.75±0.02μmmol/L、5.20±0.23μmmol/L、3.72±0.2

9、6μmmol/L。與H2組相比，H3、H4組中H2O2的分泌明顯高于H2組(P＜0.05);細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的OD值在H1、H2、H3、H4、H5組分別為36.5±6.1、638.2±26.8、1196.5±74、1400.8±111、888.2±87.2。與H2組相比，H3、H4組中ROS的分泌明顯高于H2組(P＜0.01)，表明尿酸能促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧和細(xì)胞外過(guò)氧化氫的產(chǎn)生。
　　3.ET-1在H1、H2、

10、H3、H4、H5組表達(dá)分別為199.2±13.0pg/mL、802.6±72.7pg/mL、1134.4±135.0pg/mL、1255.6±275.4pg/mL、463.1±147.0pg/mL。與H2組相比，H3、H4組中ET-1的分泌明顯高于H2組(P＜0.05);TF在H1、H2、H3、H4、H5組表達(dá)分別為74.5±7.6pg/mL、142.0±15.0pg/mL、211±26.0pg/mL、250±37.3pg/mL、254

11、.4±30.2pg/mL的水平升高。與H2組相比，H3、H4、H5組中TF的分泌明顯高于H2組(P＜0.01);ET-1、TF在mRNA水平的變化與其蛋白水平變化基本相符合，表明尿酸能使TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)水平升高。與H2組相比，H3、H4、H5組中VCAM-1的分泌明顯高于H2組(P＜0.01)。與H2組相比，H4、H5組中ICAM-1的分泌明顯高于H2組(P＜0.01)。與H2組相比，H3、H4組中IL-18的分泌明顯高