藍(lán)莓花青素中錦葵色素對TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、研究背景：
　　心血管疾病是危害人類健康的頭號殺手，而80-90％心血管疾病患者都伴隨著高血壓?！白柚垢哐獕猴嬍秤?jì)劃(DASH)”中重要的一條就是增加水果蔬菜的攝入量。細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為重要的炎癥因子，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)蛋白，能顯著增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞間粘附分子-1(VCAM-1)蛋白和mRNA的表達(dá)，促進(jìn)炎癥發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程。

2、藍(lán)莓作為功能性食品，其果實(shí)中花青素的含量很高，具有抗炎癥、增強(qiáng)心臟功能、改善血管循環(huán)、防止腦神經(jīng)衰老、明目及抗癌等獨(dú)特功效。研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花青素中錦葵色素的含量很高，因此本文以氯化錦葵色素、氯化錦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化錦葵色素-3-半乳糖苷為研究對象，研究它們對TNF-α誘導(dǎo)的體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用及糖苷協(xié)同作用，并從分子基礎(chǔ)上研究其作用機(jī)制，為心血管疾病的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　研究目的:
　　1. 體

3、外分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，采用TNF-α干預(yù)細(xì)胞，建立內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷所致的炎癥模型，觀察不同濃度氯化錦葵色素、氯化錦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化錦葵色素-3-半乳糖苷對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　2. 采用ELISA、Western Blot及RT-PCR方法檢測不同錦葵色素對細(xì)胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1的表達(dá)情況，探討它們保護(hù)HUVEC的分子機(jī)制。
　　3. 觀察細(xì)胞中及細(xì)胞核中IκBα蛋白表達(dá)情

4、況及NF-κB核轉(zhuǎn)錄情況，從分子基礎(chǔ)上解釋不同氯化錦葵色素對HUVEC炎癥的保護(hù)作用及糖苷協(xié)同作用。
　　研究方法:
　　1. 采用酶解法體外分離新鮮的嬰兒臍帶，得到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用M199完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、傳代及凍存;取3-6代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。
　　2. 采用不同濃度的腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)HUVEC4 h及采用最佳濃度的TNF-α刺激細(xì)胞不同時間，取其細(xì)胞，分別采用ELISA檢測細(xì)胞上清中MCP

5、-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表達(dá)水平;采用Western Blot檢測細(xì)胞中ICAM-1及VCAM-1蛋白表達(dá)水平，根據(jù)分析結(jié)果確定TNF-α誘導(dǎo)HUVEC最佳劑量及時效。
　　3. 采用不同濃度的氯化錦葵色素、氯化錦葵色素-3-葡萄糖苷及氯化錦葵色素-3-半乳糖及選擇最佳濃度的糖苷預(yù)處理細(xì)胞18h，加入10μg/L TNF-α刺激6h，分別采用MTT法檢測細(xì)胞活力;采用ELISA檢測細(xì)胞上清中MCP-1及VCAM-1蛋白

6、表達(dá)水平;采用Western Blot檢測細(xì)胞中ICAM-1及VCAM-1蛋白表達(dá)水平，采用熒光定量RT-PCR檢測細(xì)胞MCP-1及VCAM-1 mRNA的表達(dá)水平。
　　4. 采用最佳濃度的錦葵色素糖苷作用細(xì)胞，采用Western Blot檢測細(xì)胞中IκBα蛋白表達(dá)變化，采用核轉(zhuǎn)錄-轉(zhuǎn)運(yùn)試劑盒檢測細(xì)胞質(zhì)中NF-κB核轉(zhuǎn)錄情況，從分子基礎(chǔ)上研究抗炎癥作用的機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1. TNF-α誘導(dǎo)HUVEC表達(dá)M

7、CP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白
　　正常細(xì)胞少量表達(dá)MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白，在受到炎癥因子TNF-α刺激時，各蛋白的表達(dá)量上升。不同濃度TNF-α刺激HUVEC得到細(xì)胞上清及細(xì)胞，通過ELISA及Western Blot檢測MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白呈濃度依賴性變化，低濃度時蛋白表達(dá)量不顯著，隨著濃度增加，蛋白表達(dá)量增加，具有顯著性，尤其在濃度為10μg/L時，相比對照組MCP-1、I

8、CAM-1及VCAM-1蛋白表達(dá)具有顯著性意義(P＜0.01)。
　　采用最佳濃度10μg/L TNF-α刺激細(xì)胞不同時間，表達(dá)量呈時間依賴性變化;短刺激時間對細(xì)胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表達(dá)量影響較小，隨著刺激時間的增加，表達(dá)量亦增長，尤其在刺激時間6h，細(xì)胞上清中可溶性MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值，分別是對照組的3.762±0.041、8.436±0.367、8.554±0.06

9、9倍，具有顯著性差異(P＜0.01)。細(xì)胞中ICAM-1/β-Actin及VCAM-1/β-Actin相對表達(dá)分別為對照組的2.268±0.012(P＜0.001)、1.616±0.022(P＜0.01)倍;在刺激時間為6h時，兩者蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值。
　　2. 氯化錦葵色素抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白的表達(dá)
　　MTT法檢測細(xì)胞活力顯示:當(dāng)1、10、50、100μmol/L M

10、v-Cl、Mv-3-glc-Cl及Mv-3-gal-Cl相比空白組的抑制率為92.6％、87.6％、70.1％、64.8％，92.6％、87.6％、70.1％、64.8％及86.3％、85.1％、70.3％、61.5％，與TNF-α共同作用時，相比TNF-α刺激組具有顯著性意義(P＜0.01)，說明Mv-Cl、Mv-3-glc-Cl及Mv-3-gal-Cl不同程度的對內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，由于濃度的增加，對細(xì)胞活力具有一定的影響。

11、
　　采用ELISA、Western Blot及RT-RCR檢測細(xì)胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白及mRNA表達(dá)情況，正常情況下，正常細(xì)胞少量表達(dá)MCP-1、ICAM-1及 VCAM-1蛋白及mRNA，當(dāng)細(xì)胞受到炎癥因子TNF-α刺激時，三種因子的表達(dá)量上升，當(dāng)不同濃度Mv-Cl(1、10、50、100μmol/L)作用細(xì)胞時，蛋白及mRNA的表達(dá)量相比TNF-α刺激組具有顯著下降，尤其是濃度為50、100μmol/

12、L時，三種因子的抑制率達(dá)到90％以上，接近于正常組，說明隨著濃度的增加，Mv-Cl對TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥具有保護(hù)作用.
　　3. 氯化錦葵色素-3-O-葡萄糖苷及半乳糖苷抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白的表達(dá)
　　通過ELISA、Western Blot及RT-PCR方法檢測細(xì)胞中MCP-1、ICAM-1及VCAM-1蛋白及mRNA變化，得出:不同濃度的Mv-3-glc-Cl

13、、Mv-3-gal-Cl對TNF-α引起的炎癥反應(yīng)呈濃度依賴式保護(hù)作用。對于細(xì)胞中MCP-1及VCAM-1蛋白或mRNA，Mv-3-glc-Cl比Mv-3-gal-Cl抑制效果更明顯，但在低濃度刺激時，對于細(xì)胞中ICAM-1，Mv-3-gal-Cl比Mv-3-glc-Cl作用效果明顯，但隨著濃度增加，葡萄糖苷式作用比半乳糖苷式發(fā)揮更強(qiáng)的保護(hù)作用。
　　4. 糖苷氯化錦葵色素協(xié)同抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC中MCP-1、ICAM-

14、1及VCAM-1蛋白的表達(dá)及分子機(jī)理研究
　　通過ELISA法及Werstern Blot及RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)預(yù)處理的Mv-3-glc-Cl、Mv-3-gal-Cl和(Mv-3-glc-Cl+Mv-3-gal-Cl)對MCP-1、 ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表達(dá)相比單獨(dú)刺激TNF-α組具有明顯的抑制作用，并且具有協(xié)同作用。通過Western Blot檢測細(xì)胞質(zhì)中IκBα蛋白得出，正常細(xì)胞受到TNF-α介導(dǎo)時，IκB

15、α蛋白含量降低，驗(yàn)證了IκBα被降解，從而表達(dá)MCP-1，ICAM-1和VCAM-1;而當(dāng)孵育不同濃度氯化錦葵色素時，IκBα相對降解量相比TNF-α組減少。此外，通過免疫熒光檢測NF-κ Bp65核轉(zhuǎn)運(yùn)情況也得到相應(yīng)結(jié)果，正常細(xì)胞NF-κB捕捉的熒光強(qiáng)度很弱。單獨(dú)TNF-α組NF-κB捕捉的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，隨著Mv-3-glc-Cl、Mv-3-gal-Cl和(Mv-3-glc-Cl+Mv-3-gal-Cl)的加入，NF-κB熒光強(qiáng)度相對